用于診斷冠心病的代謝標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，設(shè)及疾病診斷標(biāo)志物，具體設(shè)及一組用于診斷冠屯、病 的代謝標(biāo)志物。
【背景技術(shù)】
[0002] 冠屯、病亦稱為缺血性屯、臟病，設(shè)及供應(yīng)屯、肌血液的動脈發(fā)生粥樣硬化，即冠狀動 脈粥樣硬化病變引起血管腔狹窄或斑塊形成甚至破裂、完全堵塞，造成屯、肌缺血、缺氧或壞 死而導(dǎo)致屯、臟缺血性疾病，從而引起臨床上屯、絞痛、屯、肌梗死等一系列嚴(yán)重的屯、血管事件。 冠屯、病是人類健康的主要殺手，具發(fā)病率高、致殘率高、復(fù)發(fā)率高、病死率高、并發(fā)癥多等特 點，已經(jīng)成為威脅我國人民健康的主要疾病。
[0003] 冠狀動脈粥樣硬化是冠屯、病的主要病因，是冠屯、病的早期病癥。動脈粥樣硬化是 一種常見的進(jìn)行性動脈疾病，病變主要累及中等大小的肌層動脈，動脈內(nèi)膜脂質(zhì)沉積，平滑 肌細(xì)胞增生，形成局限性斑塊，可使動脈壁變硬，嚴(yán)重時斑塊破裂導(dǎo)致血栓、栓塞、出血，受 累管腔部分或完全閉塞，臨床表現(xiàn)為動脈粥樣硬化血管并發(fā)癥的發(fā)生，老年患者中最常見 和最嚴(yán)重的血管并發(fā)癥是冠屯、病(不穩(wěn)定性屯、絞痛和屯、肌梗塞）。動脈粥樣硬化早期病變可 發(fā)生在10歲之前，病變引起動脈狹窄需經(jīng)歷20至30年時間，早期無臨床癥狀，不易被發(fā)現(xiàn)和 重視，因此對冠狀動脈粥樣硬化的早期預(yù)防和診斷可W有效地防止冠屯、病的發(fā)生。
[0004] 冠狀動脈造影可W對冠狀動脈的狹窄程度作出準(zhǔn)確的判斷，是診斷冠屯、病的金標(biāo) 準(zhǔn)[冠狀動脈造影金標(biāo)準(zhǔn)與臨床常規(guī)診斷冠屯、病差異性比較研究，舒榮文等，海軍醫(yī)學(xué)雜志 2015年04期]。作為冠屯、病診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，冠脈造影只能發(fā)現(xiàn)血管狹窄程度，而且它還是一 種介入測量手段，需要介入手術(shù)，且診斷昂貴。另一方面，醫(yī)生還需要依據(jù)對患者的屯、電圖、 屯、動圖、平板運動試驗、CT等檢查結(jié)果作出最終診斷，由于醫(yī)生主觀性判斷、病人敘述不清 等情況的出現(xiàn)，對冠屯、病的診斷仍存在較大的誤診和漏診，運對病人的預(yù)后影響非常大。為 了改善患者的生活質(zhì)量，降低患者受到的生命威脅，我們亟需發(fā)展一種具有診斷率高、經(jīng) 濟(jì)、無侵入性、操作簡便等特性的診斷方法。
[0005] 代謝組學(xué)是研究生物體內(nèi)源性代謝物質(zhì)的整體及其隨內(nèi)因和外因變化的科學(xué)，是 系統(tǒng)生物學(xué)的一個重要組成部分。它可W對體液如血液和尿液進(jìn)行快速及無侵入性的分 析，通過代謝譜的差異獲得可W指示各種生化反應(yīng)的代謝標(biāo)志物。目前常用的分析技術(shù)包 括核磁共振(NMR)、質(zhì)譜化C-MS/GC-MS)等。LC-MS/GC-MS具有對樣本制備要求低、靈敏度高、 動態(tài)范圍寬等特點，可用于檢測樣本中濃度相差大的代謝物，因而成為代謝組學(xué)的研究中 應(yīng)用越來越多的技術(shù)平臺。
[0006] 血漿分析是臨床上常用的一種疾病診斷方法，因其簡便、快速、經(jīng)濟(jì)且相對無創(chuàng)的 優(yōu)點而被廣泛采用。目前尚未有人使用血漿代謝物水平對冠屯、病進(jìn)行診斷。應(yīng)用血漿代謝 組學(xué)尋找代謝標(biāo)志物W診斷冠屯、病對于臨床早期快速確診冠屯、病具有重要意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明第一目的在于提供一組用于診斷冠屯、病的代謝 標(biāo)志物，該組代謝標(biāo)志物同時存在于血漿中，可同時分析測定;本發(fā)明的第二目的在于提供 一種能夠靈敏地分析檢測所述代謝標(biāo)志物的方法;本發(fā)明的第Ξ目的在于提供所述代謝標(biāo) 志物在篩選治療或緩解冠屯、病的藥物中的應(yīng)用;本發(fā)明的第四目的在于提供一種基于所述 代謝標(biāo)志物的檢測試劑盒，用于診斷冠屯、病，提高診斷便利性，促進(jìn)診斷方法標(biāo)準(zhǔn)化;本發(fā) 明的第五目的在于提供所述檢測試劑盒在篩選治療或緩解冠屯、病的藥物中的應(yīng)用。
[0008] 上述目的是通過如下技術(shù)方案得W實現(xiàn)的：
[0009] -組用于診斷冠屯、病的代謝標(biāo)志物，包括一個或多個如下所述的代謝標(biāo)志物：1-棟桐酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、1-十八碳四締酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、1-亞油酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、1-硬脂酷-sn-甘油-3憐脂酷膽堿、1-亞油酷-2-?基-sn-甘油-3-憐脂 酷乙醇胺、1-亞麻酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、1-油酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、1-十六碳締 酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、植物銷氨醇和十六酷胺；
[0010] 所述診斷包括診斷區(qū)分冠屯、病患者與健康人，還包括診斷區(qū)分冠屯、病患者與冠狀 動脈粥樣硬化患者。
[0011] 進(jìn)一步地，包括任意兩個所述的代謝標(biāo)志物。
[0012] 進(jìn)一步地，包括任意Ξ個所述的代謝標(biāo)志物。
[0013] 進(jìn)一步地，包括任意四個所述的代謝標(biāo)志物。
[0014] 進(jìn)一步地，所述的代謝標(biāo)志物來源于血漿。
[0015] -種定性或定量分析所述的代謝標(biāo)志物的方法，通過液質(zhì)聯(lián)用和/或氣質(zhì)聯(lián)用對 所述的代謝標(biāo)志物定性或定量。液質(zhì)和氣質(zhì)檢測限低、靈敏度高，能靈敏地分析檢測生物樣 本中的代謝標(biāo)志物并對其定量。
[0016] 冠屯、病治療或緩解后，會在代謝標(biāo)志物的表達(dá)水平上有所體現(xiàn)。因此，所述的代謝 標(biāo)志物可W用于篩選治療或緩解冠屯、病的藥物。
[0017] -種用于診斷冠屯、病的檢測試劑盒，包括所述的代謝標(biāo)志物的標(biāo)準(zhǔn)品，所述標(biāo)準(zhǔn) 品為各代謝標(biāo)志物的化學(xué)單體或混合物。使用標(biāo)準(zhǔn)品可W對生物樣本中的代謝標(biāo)志物進(jìn)行 快速準(zhǔn)確地定性、定量分析。試劑盒有助于實現(xiàn)檢測標(biāo)準(zhǔn)化，提高檢測便利性和重現(xiàn)性。
[0018] 進(jìn)一步地，所述檢測試劑盒還包括溶解所述標(biāo)準(zhǔn)品的溶劑和/或提取富集所述代 謝標(biāo)志物的溶劑。
[0019] 所述的檢測試劑盒在篩選治療或緩解冠屯、病的藥物中的應(yīng)用。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點：
[0021] (1)本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物能精確診斷冠屯、病，既能診斷區(qū)分冠屯、病患者與健 康人，又能診斷區(qū)分冠屯、病患者與冠狀動脈粥樣硬化患者。R0C曲線評價方法中，R0C曲線下 的面積值A(chǔ)UC在大于0.5的情況下，越接近于1，說明診斷效果越好。AUC在0.5~0.7時有較低 準(zhǔn)確性，AUC在0.7~0.9時有一定準(zhǔn)確性，AUC在0.9 W上時有較高準(zhǔn)確性。經(jīng)驗證，本發(fā)明提 供的代謝標(biāo)志物單個用于診斷區(qū)分冠屯、病患者與健康人或診斷區(qū)分冠屯、病患者與冠狀動 脈粥樣硬化患者時，AUC均在0.7W上；多個聯(lián)合應(yīng)用時，AUC比單個更接近于1，診斷效果更 好;十個聯(lián)合應(yīng)用時，AUC最接近于1，診斷區(qū)分效果最好。
[0022] (2)本發(fā)明提供的分析檢測所述代謝標(biāo)志物的方法靈敏度高，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。
[0023] (3)本發(fā)明提供的代謝標(biāo)志物可W有效診斷冠屯、病的病情是否得到緩解，可W用 于篩選治療或緩解冠屯、病的藥物。
[0024] (4)本發(fā)明提供的試劑盒可W用于診斷冠屯、病，提高診斷便利性，促進(jìn)診斷方法標(biāo) 準(zhǔn)化。
[0025] (5)本發(fā)明提供的基于所述代謝標(biāo)志物的試劑盒可W有效診斷冠屯、病的病情是否 得到緩解，可W用于篩選治療或緩解冠屯、病的藥物。
【具體實施方式】
[0026] 下面結(jié)合實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明實質(zhì)性內(nèi)容。使用的儀器或試劑未做詳細(xì)說明 的均為常規(guī)儀器和試劑;未具體描述的試驗操作方法均為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的常規(guī) 操作方法。
[0027] 實施例1:冠屯、病患者與非冠屯、病患者(包括健康人和冠狀動脈粥樣硬化患者）之 間血漿差異性代謝物的篩選表征
[002引一、對象和方法
[0029] 1、標(biāo)本來源
[0030] 在取得患者同意后，收集江蘇省人民醫(yī)院2010年9月~2015年6月480例冠狀動脈 粥樣硬化患者、867例冠屯、病患者和350例健康人的外周靜脈血血漿，所有患者或健康人均 經(jīng)冠脈造影證實。健康人的年齡、性別與冠狀動脈粥樣硬化患者、冠屯、病患者相匹配。所有 冠狀動脈粥樣硬化患者、冠屯、病患者和健康人均有正常的屯、肺肝腎及造血功能。
[0031]義血時間均為清晨至腹?fàn)顟B(tài)。
[0032] 2、主要試劑
[0033] 乙臘及甲酸化化C純）購于美國ROE公司；色譜級別甲醇和氯仿購于江蘇漢邦科技 有限公司；氯化甲氧胺及N-甲基-Ν-(Ξ甲基硅烷)Ξ氣乙酷胺(含1%Ξ甲基氯硅烷)購于美 國Sigma-Al化ich公司；去離子水由美國密理博(Millipore)公司的MIlli-Q超純水系統(tǒng)制 備;標(biāo)準(zhǔn)品包括1-棟桐酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、1-十八碳四締酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽 堿、1-亞油酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、1-硬脂酷-sn-甘油-3憐脂酷膽堿、1-亞油酷-2-徑 基-sn-甘油-3-憐脂酷乙醇胺、1-亞麻酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、1-油酷-sn-甘油-3-憐脂 酷膽堿、1-十六碳締酷-sn-甘油-3-憐脂酷膽堿、植物銷氨醇和十六酷胺，購于美國Sigma-Aldrich。
[0034] 3、血漿差異性代謝物的表征
[0035] 3.1UPLC-Q/T0F-MS 篩選表征
[0036] 3.1.1樣品制備
[0037] 利用響應(yīng)面法進(jìn)行提取溶劑優(yōu)化：W質(zhì)譜ESI+和ESI-檢測模式下的峰個數(shù)和總峰 面積為因素考察不同溶劑（乙臘、甲醇、乙醇、氯仿、水)對血漿中代謝物的提取富集效率。將 實驗測得數(shù)據(jù)進(jìn)行多變量分析，利用化S模型中重要性因子（variable impodance to projection, VIP值)反映變量對模型響應(yīng)的重要性。乙臘、甲醇、乙醇、氯仿、水的VIP值依次 為1.503，0.802，0.651，0.688和0.987，乙臘的提取效率最高，故選擇乙臘作為血漿樣本的 提取溶劑。
[003引樣品處理：取100化血漿于1.5mL離屯、管中，加入400化乙臘，滿旋30秒后混勻， 1300化pmX lOmin離屯、(4°C)，取20化L上清于1.5mL離屯、管中，在室溫下用氮吹儀吹干，所得 殘渣用3(Κ)化的20 %乙臘水溶液溶解，即得。
[0039] 3.1.2檢測表征
[0040] UPLC-Q/T0F-MS 條件：
[0041 ] 色譜分離采用超高效液相色譜化化C，Agilent 1290，USA)。色譜柱為Waters邸Η C18柱（100mmX 2.1mm，1.7皿），柱溫25°C，進(jìn)樣室溫度為室溫，進(jìn)樣量化L。正、負(fù)離子模式流 動相組成均是A為體積濃度0.1 %甲酸水溶液，B為體積濃度0.1 %甲酸乙臘溶液。梯度洗脫 條件:0~Imin為0~30%B相，2min內(nèi)B相線性增加到60%，3~8min線性變化至90%B相，然 后在8~9min線性增加至100%B相并保持Imin;流速0.3mL/min，柱后流出液不經(jīng)分流直接 導(dǎo)入質(zhì)譜系統(tǒng)檢測。
[0042] 質(zhì)譜分析采用四級桿-飛行時間質(zhì)譜(Agilent 6530Q-T0F/MS，USA)dW電噴霧離 子源化SI)正、負(fù)離子模式檢測;干燥氣流速為化/min，干燥氣溫度為300°C，干燥氣和錐孔 氣均為高純氮氣;離子源溫度l〇〇°C，正離子和負(fù)離子模式下毛細(xì)管電壓均為3000V，碰撞電 壓為100V;采用全掃描模式每秒進(jìn)行Ξ次數(shù)據(jù)采集，掃描質(zhì)量范圍:m/z 100-1000道爾頓。
[0043] 3.2GC-Q/MS 篩選表征
[0044] 3.2.1樣品制備
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