光子重組的非線性超分辨顯微方法及裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于共聚焦顯微領(lǐng)域，特別涉及一種光子重組的非線性超分辨顯微方法及 裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] -直以來(lái)，傳統(tǒng)的遠(yuǎn)場(chǎng)焚光顯微技術(shù)由于衍射極限的存在，因此在納米技術(shù)、材 料、生物以及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域等的應(yīng)用受到很大的限制。為了解決這一問(wèn)題，自從上個(gè)世紀(jì)90年代 開(kāi)始，人們提出了很多超分辨顯微方法。在這些所提出的方法中，熒光差分顯微技術(shù)(FED) 成為新近提出的方法中可以在不使用熒光標(biāo)記的情況下分析生物樣品。熒光差分顯微術(shù)基 于的是共聚焦顯微成像技術(shù)，它是利用兩個(gè)通過(guò)特定激發(fā)的光斑掃描得到的兩張圖像之差 來(lái)獲得分辨率的提高的。即待分析的樣品是分別被一個(gè)實(shí)心光斑接著被一個(gè)空心光斑照 明，將兩者以不同的比重進(jìn)行相減運(yùn)算即可重構(gòu)出超分辨圖像。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，熒光差分顯 微在遠(yuǎn)場(chǎng)可以獲取小于四分之波長(zhǎng)的分辨率并且具有較高的信噪比。
[0003] 然而，這種熒光差分顯微術(shù)存在圖像變形以及信息丟失的問(wèn)題。在之前的系統(tǒng)中， 空心光斑是通過(guò)采用一個(gè)〇到2π的渦旋位相板調(diào)制一個(gè)與之同向的圓偏光實(shí)現(xiàn)的。由于空 心照明光斑的輪廓比實(shí)心光斑的要大得多，兩者相減后將導(dǎo)致獲得的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)出現(xiàn) 負(fù)值旁瓣，而某些正值的強(qiáng)度可以通過(guò)負(fù)值強(qiáng)度來(lái)補(bǔ)償，因此在圖像重構(gòu)的過(guò)程中，去除的 負(fù)值強(qiáng)度將導(dǎo)致信息的丟失。這個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵解決方法便是找到某種方法使產(chǎn)生的實(shí)心和 空心光斑具有大致相等的尺寸。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明提供了一種光子重組的非線性超分辨顯微方法和裝置，相對(duì)于其他超分辨 成像顯微鏡，該裝置是基于共聚焦顯微鏡，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，成像速度快，為生命科學(xué)和納米技 術(shù)提供了良好的研究手段。
[0005] 本發(fā)明通過(guò)光子重組以消除圖像變形而實(shí)現(xiàn)超分辨成像的方法，這種方法被稱為 飽和光照明虛擬熒光差分超分辨顯微術(shù)(svFED)。本顯微術(shù)通過(guò)高功率激光照明以達(dá)到熒 光的非線性效應(yīng)，采用針孔探測(cè)器陣列取代傳統(tǒng)共焦顯微成像中放置于像面上的單個(gè)針孔 探測(cè)器，利用光子重組技術(shù)，結(jié)合類(lèi)似于熒光差分顯微術(shù)(FED)的方法，僅僅掃描所獲取的 空心光斑而無(wú)需獲取實(shí)心光斑，從而大大簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)裝置并進(jìn)一步提高了成像速度；同時(shí) 由于不存在負(fù)值旁瓣，使系統(tǒng)消除了成像變形這一困擾。仿真結(jié)果顯示光子重組的非線性 超分辨率顯微術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)共聚焦顯微術(shù)可提高至少39%。
[0006] 本發(fā)明的具體技術(shù)方案如下：
[0007] 本發(fā)明提供了一種光子重組的非線性超分辨顯微方法，針對(duì)熒光樣品包括以下步 驟：
[0008] (1)激光器發(fā)出高功率照明光束，經(jīng)第一透鏡準(zhǔn)直和擴(kuò)束后得到準(zhǔn)直擴(kuò)束光束;所 述準(zhǔn)直擴(kuò)束后的照明光束經(jīng)第一偏振片后，得到線偏振光；
[0009] (2)所述線偏振光經(jīng)第一反射鏡反射后進(jìn)入0~231渦旋位相板調(diào)制入射光的相位； 所述被調(diào)制位相后的線偏光經(jīng)第一四分之一波片后補(bǔ)償了后面的二色鏡和第二反射鏡造 成的位相差，使其在經(jīng)第二反射鏡反射后的出射光為準(zhǔn)確的線偏光;所述位相差得到補(bǔ)償 的偏振光經(jīng)半波片后得到改變了線偏振方向的出射光;所述出射光經(jīng)二色鏡反射后進(jìn)入第 二反射鏡;所述經(jīng)第二反射鏡反射的反射光再經(jīng)過(guò)第二四分之一波片后變成位相受到調(diào)制 的圓偏振光;所述位相受到調(diào)制的圓偏光經(jīng)過(guò)物鏡后聚焦到位于所述物鏡焦面處樣品平面 上形成空心光斑照明熒光樣品；
[0010] (3)所述熒光樣品被高功率的空心光斑照明后，在非線性的作用下，產(chǎn)生飽和效 應(yīng)，激發(fā)出飽和熒光;所述達(dá)到飽和效應(yīng)的熒光被所述物鏡收集，經(jīng)所述第二四分之一波片 后由所述第二反射鏡反射后進(jìn)入所述二色鏡;所述熒光經(jīng)所述二色鏡透射后進(jìn)入濾光片濾 光后進(jìn)入第二透鏡;所述經(jīng)濾光片濾光后的熒光由第二透鏡會(huì)聚到由多個(gè)光電探測(cè)器組成 的探測(cè)器陣列上參與成像；
[0011] (4)所述探測(cè)器陣列將光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并傳送給計(jì)算機(jī);所述計(jì)算機(jī)將每個(gè) 探測(cè)器探測(cè)到的空心光斑做相應(yīng)的平移后疊加，得到實(shí)心光斑的圖像，完成了對(duì)樣品一個(gè) 點(diǎn)的信息讀入和處理；
[0012] (5)所述熒光樣品放置于納米移動(dòng)平臺(tái)上;所述樣品平臺(tái)與所述計(jì)算機(jī)相連，通過(guò) 所述計(jì)算機(jī)的控制軟件實(shí)現(xiàn)納米移動(dòng)平臺(tái)的在二維平面的移動(dòng)完成對(duì)所述熒光樣品的二 維掃描。
[0013] 本發(fā)明還提供了一種光子重組的非線性超分辨顯微裝置，針對(duì)熒光樣品包括：
[0014] (1)高功率激光器，用于發(fā)出短波長(zhǎng)高功率激光，實(shí)現(xiàn)對(duì)熒光樣品的照明，利用熒 光的非線性效應(yīng)，以使其達(dá)到飽和從而激發(fā)飽和熒光；
[0015] (2)第一透鏡，用于對(duì)激光器發(fā)出的激光進(jìn)行準(zhǔn)直和擴(kuò)束；
[0016] (3)偏振片，用于使準(zhǔn)直并擴(kuò)束后的激光變成線偏振光；
[0017] (4)第一反射鏡、第二反射鏡，用于反射光路，使光路變得緊湊；
[0018] (5)0~2π渦旋位相板，用于調(diào)制入射光的相位，從而使所述激光在樣品面聚焦時(shí) 形成空心光斑；
[0019] (6)第一四分之一波片，用于補(bǔ)償入射光經(jīng)后面的二色鏡和第二反射鏡后帶來(lái)的 位相差，使其在經(jīng)第二反射鏡反射后為準(zhǔn)確的線偏光；
[0020] (7)二分之一波片，用于調(diào)整入射光的線偏振方向；
[0021] (8)二色鏡，用于使激光反射同時(shí)使被激發(fā)的熒光透射；
[0022] (9)第二四分之一波片，用于使相位受到調(diào)制的入射光變成圓偏振光；
[0023] (10)物鏡，用于將相位受到0~2π調(diào)制的圓偏振光會(huì)聚到樣品面上，收集熒光樣品 被激發(fā)后所發(fā)出的熒光；
[0024] (11)濾光片，用于濾除經(jīng)所述樣品面反射回來(lái)的激光，而僅使熒光樣品發(fā)出的熒 光通過(guò)參與成像；
[0025] (12)第二透鏡，用于將所述熒光樣品發(fā)出的熒光會(huì)聚到所述探測(cè)器陣列上；
[0026] (13)探測(cè)器陣列，由15x15個(gè)帶有針孔的光電探測(cè)器所組成的陣列，如圖3所示的 矩形陣列，用于將探測(cè)到的光信號(hào)轉(zhuǎn)換為電信號(hào)并傳送至計(jì)算機(jī)；
[0027] (14)納米平移臺(tái)，通過(guò)控制納米位移平臺(tái)完成對(duì)樣品的二維平面掃描；
[0028] (15)計(jì)算機(jī)，用于處理探測(cè)器傳送過(guò)來(lái)的信號(hào)，同時(shí)控制納米移動(dòng)平臺(tái)的平動(dòng)使 其完成對(duì)樣品的二維平面掃描。
[0029] 本發(fā)明的原理如下：
[0030] 本發(fā)明在傳統(tǒng)共聚焦顯微鏡裝置(如圖1所示）的基礎(chǔ)上，首先經(jīng)準(zhǔn)直擴(kuò)束后的高 功率激光光束入射到一偏振片后變成線偏光，線偏光再經(jīng)過(guò)0~231渦旋位相板調(diào)制后經(jīng)過(guò) 物鏡前的四分之一波片后形成位相受到調(diào)制的圓偏振光，再由物鏡聚焦到位于其焦面上的 樣品平面后形成高強(qiáng)度空心光斑，激發(fā)光照明熒光樣品后使其激發(fā)產(chǎn)生熒光。當(dāng)激發(fā)光強(qiáng) 度較小時(shí)，所激發(fā)的熒光強(qiáng)度與激發(fā)光強(qiáng)成正比，當(dāng)激發(fā)光強(qiáng)I超過(guò)某一臨界值Is后，如果 持續(xù)增加光強(qiáng)，熒光將產(chǎn)生非線性效應(yīng)，即熒光的發(fā)射強(qiáng)度將保持恒定，產(chǎn)生熒光飽和現(xiàn) 象。這是由于較強(qiáng)的激發(fā)光造成熒光分子的吸收截面減小，從而降低了分子實(shí)際捕獲激發(fā) 光光子的能力，BP
[0031] 〇'cs = ocs(l+I/Is)
[0032]其中，〇'。3為熒光分子的實(shí)際吸收截面，ocs = 23t(A/2jt)2( yr/ Γ tC)t)為熒光分子的 吸收截面，Γ tclt，γ 4Ρλ分別為吸收總頻率寬、自發(fā)輻射熒光率和激發(fā)光波長(zhǎng)。此時(shí)的點(diǎn)擴(kuò) 散函數(shù)將產(chǎn)生變形，其峰值將被削平，如圖5所示。這種變形后的點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)在空間頻域內(nèi) 包含更多的高頻分量，從而可以探測(cè)物體更多的高頻信息。物鏡將收集到的飽和熒光經(jīng)成 像光路后，最終成像在探測(cè)器陣列上，則探測(cè)器陣列上所記錄的光強(qiáng)為：
[0033]
[0034] 其中，？代表樣品上被掃描的位置矢量，？'代表物空間上的物的位置矢量，J代表 探測(cè)器所在的位置矢量，〇表示熒光樣品發(fā)出的光強(qiáng);有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)為：
[0035]
[0036] 式中：ΜΚ?')代表激發(fā)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，分')代表探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)，共輒焦點(diǎn)處 的針孔探測(cè)器單元所對(duì)應(yīng)的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)如圖6所示。
[0037] 當(dāng)探測(cè)器單元不是處在共輒焦點(diǎn)上時(shí)，該探測(cè)器單元所探測(cè)到的探測(cè)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù) 將發(fā)生平移，從而使有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的峰值產(chǎn)生平移，如圖7(a)中的點(diǎn)虛線和線虛線所示 分別表示距離共輒點(diǎn)探測(cè)器±〇.25λ處所對(duì)應(yīng)的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。故假如直接將每個(gè)探測(cè) 器單元所獲得的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)加起來(lái)，則所獲得的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)將產(chǎn)生較大的輪廓， 從而與未采用針孔探測(cè)器的共焦顯微一樣降低了分辨率。所以，在已知探測(cè)器陣列中每個(gè) 探測(cè)單元的實(shí)際位置時(shí)，將每個(gè)探測(cè)器單元所對(duì)應(yīng)的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)作一定的平移，如圖7 (b)點(diǎn)虛線和線虛線所示，然后再相加，這一過(guò)程被稱為光子重組，用公式表示即：
[0038]
[0039] 其中q稱為平移因子，采用卷積的形式寫(xiě)出該光強(qiáng)即為：
[0040]
[0041]
[0042]
[0043] 由于探測(cè)器陣列中的每個(gè)探測(cè)單元所獲得的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)的空心暗斑位置都 與共輒焦點(diǎn)處探測(cè)器單元所得到的暗斑位置重合，當(dāng)對(duì)探測(cè)器陣列中的每個(gè)探測(cè)單元所對(duì) 應(yīng)的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)作光子重組后，中心暗斑位置處將被光子填充，從而使作光子重組后 的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)變成一個(gè)中心較周?chē)鷱?qiáng)度稍低的實(shí)心光斑，其有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)如圖8所 不。
[0044]那么利用與熒光差分(FED)-樣的原理，將光子重組所獲得的實(shí)心光斑對(duì)應(yīng)的有 效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)減去一定比例的處于熒光樣品共輒點(diǎn)處探測(cè)單元所得到的空心光斑對(duì)應(yīng)的 有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)即可獲得一個(gè)光斑更小的實(shí)心光斑，所對(duì)應(yīng)的有效點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)如圖9所示。 對(duì)于處于共輒點(diǎn)的探測(cè)單元所得到空心光斑的光強(qiáng)分布為：
[0045]
[0046]
[0047]
[0048]則重構(gòu)圖像后的光強(qiáng)為：
[0049]
[0050] 其中，p為減數(shù)因子。采用卷積形式可以寫(xiě)成：
[0051]
[0052]
[0053]
[0054]適當(dāng)選擇平移因子q和減數(shù)因子p可以獲得一個(gè)半高全寬很小的重構(gòu)點(diǎn)擴(kuò)散函數(shù)。 如此便完成了對(duì)單個(gè)物點(diǎn)的圖像讀入和處