冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫?抗體的預(yù)處理：將要標(biāo)記的新霉素抗體在1000 r/min, 4°C條件下，離心20 min,取上 清，用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 1 mg/mL;或者用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 1 mg/ml，過 0.22 Mm濾膜； 膠體金標(biāo)記物的制備：取步驟（1)中的膠體金溶液40 mL，用0.25 mol/L K2C03調(diào)節(jié)膠 體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌，逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白的蛋 白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min;金標(biāo)抗體溶液常溫低 速（1500 r/min)離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C，12000 r/min離心20 min,棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至1 mL,制備成新霉 素單克隆抗體膠體金標(biāo)記物； 膠體金膜的制備：將步驟（3)新霉素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃膜儀 以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制成含 新霉素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜； 包被膜制備：將羊抗鼠 IgG抗體、新霉素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成1 mg/mL，用劃膜儀依次 以1 PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾干 或者37 °C烘干； 樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60%的 條件下，室溫自然晾干； 檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組裝 成試紙條，切割成一定寬度長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。
[0015] 實(shí)施例3 新霉素最低檢出限量試驗(yàn) 準(zhǔn)確稱量〇. 500 g新霉素抗原溶于超純水并定容至100 mL，標(biāo)為Ai溶液，取Ai溶液1 mL于容量瓶加超純水并定容至1000 mL，形成A2溶液，取A2溶液1 mL于容量瓶加超純水并 定容至1000 mL，形成A3溶液，則A3溶液的濃度為5 ng/mL (5ppb)。取A3溶液1 mL于4支 試管中，并分別標(biāo)號1~4,往試管中分別加入往9 mL、4 mL、l mL、0 mL超純水，配成新霉素抗 原溶液濃度分別是：0.5 ng/mL、l ng/mL、2.5 ng/mL、5 ng/mL;另取一支空試管，加入5 mL 超純水，標(biāo)為5號試管。取上述1飛號試管中液體作為樣品滴加到新霉素檢測卡上，加樣后 5 min觀察結(jié)果，檢測線2和質(zhì)控線3的顯色結(jié)果見表1。
[0016] 表1新霉素最低檢出限量試驗(yàn)
經(jīng)多次檢驗(yàn)，新霉素的檢出率達(dá)99%，最低檢出限量為5 ng/mL。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 新霉素膠體金檢測卡，其特征在于按照下述步驟制備得到： (1) 膠體金溶液制備：取1 L三角燒瓶1個(gè)，加入超純水495 mL，而后加入1%氯金酸 HAuC14*3H20)5 mL，配制成500 mL 0.01%氯金酸水溶液，加熱煮沸后在持續(xù)攪拌的情況下 加入1%檸檬酸三鈉 Na3C6H507 · 2H20溶液5-7 mL，繼續(xù)攪拌加熱，當(dāng)溶液的顏色完全變?yōu)橥?明的紫紅色時(shí)，維持5 min后停止加熱，補(bǔ)水至原體積，冷卻至室溫，2-8°C保存?zhèn)溆茫? (2) 抗體的預(yù)處理：將要標(biāo)記的新霉素抗體在1000 r/min，4°C條件下，離心20 min,取 上清，用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 1 mg/mL;或者用 0.01 mol/L PBS 稀釋成 1 mg/ml，過 0.22 Mm濾膜； ⑶膠體金標(biāo)記物的制備：取步驟⑴中的膠體金溶液40 mL，用0. 25 mol/L 1(20)3調(diào) 節(jié)膠體金溶液pH至8. 5,電磁攪拌器250 r/min攪拌，逐滴加入4 mL含0.3 mg抗體蛋白 的蛋白溶液，反應(yīng)10 min;逐滴加入4 mL 10% BSA，繼續(xù)攪拌反應(yīng)10 min;金標(biāo)抗體溶液常 溫1500 r/min離心10 min,棄去由凝聚的金顆粒形成的沉淀；紅色上清溶液4°C，12000 r/ min離心20 min,棄上清，收集沉淀，將沉淀用金標(biāo)抗體稀釋液定容至1 mL,制備成新霉素 單克隆抗體膠體金標(biāo)記物； (4) 膠體金膜的制備：將步驟（3)新霉素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物用劃 膜儀以5 PL/cm的濃度均勻噴在載體玻璃纖維素膜上，室溫自然晾干或者37°C烘干3 h，制 成含新霉素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物單克隆抗體膠體金標(biāo)記物的膠體金膜； (5) 包被膜制備：將羊抗鼠 IgG抗體、新霉素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物稀釋成1 mg/mL，用劃膜儀依 次以1 PL/cm的濃度噴涂在硝酸纖維素膜上，制備成包被膜，37°C包被2 h后，室溫自然晾 干或者37 °C烘干； (6) 樣品墊前處理：將樣品墊處理液均勻涂布在玻璃纖維素膜上，在空氣濕度低于60% 的條件下，室溫自然晾干； (7) 檢測卡的組裝：PVC膠板自上而下依次粘貼樣品墊、膠體金膜、包被膜和吸水棉，組 裝成試紙條，切割成一定寬度的長條，再將試紙條安裝在長條扁平殼狀的檢測卡外殼中。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的新霉素膠體金檢測卡，其特征在于所述步驟（5)中所包被的 檢測線T設(shè)在質(zhì)控線C的下方； 所述步驟（6)中的樣品墊處理液是由1 g小牛血清蛋白（BSA)和0. 8 g氯化鈉（NaCl), 用含有 0· 5%TRIT0N-100 的 0· 01 mol/L PBS 定容至 100 mL。
【專利摘要】本發(fā)明新霉素的免疫膠體金檢測卡及其制備方法,涉及β-腎上腺素受體激動(dòng)劑檢測技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的檢測卡外殼中的試紙條，由PVC膠板、樣品墊、膠體金結(jié)合墊、包被膜和吸水墊組成；膠體金膜為含新霉素單克隆抗體的玻璃纖維素膜，包被膜是硝酸纖維素膜，其上設(shè)有T線和C線，T線包被有新霉素蛋白質(zhì)偶聯(lián)物，C線包被有羊抗鼠IgG抗體。本發(fā)明有效用于快速檢測新霉素，方便、快捷、結(jié)果準(zhǔn)確。
【IPC分類】G01N33/532, G01N33/577
【公開號】CN105510587
【申請?zhí)枴緾N201410547766
【發(fā)明人】洪霞, 杜霞, 江振飛
【申請人】鎮(zhèn)江先創(chuàng)生物科技有限公司
【公開日】2016年4月20日
【申請日】2014年10月16日