過夜，其間換水3次以上；取出 10000g離心30分鐘，除去不溶性沉渣，測(cè)定蛋白質(zhì)含量后，分裝，凍存?zhèn)溆谩?br>[0056] 二、VEGF多克隆抗體的制備和純化
[0057]用家兔作為免疫動(dòng)物，先用5-10mg卡介苗注射刺激動(dòng)物。一周后，將VEGF蛋白制成 福氏安全佐劑，采用皮下注射進(jìn)行第一次免疫。2周后，進(jìn)行第二次免疫。2周后，抽血測(cè)效 價(jià)，若效價(jià)偏低，則進(jìn)行加強(qiáng)免疫。采集家兔全血，離心取血清。利用正辛酸一硫酸銨沉淀法 和DEAE離子交換純化，所得抗體溶液達(dá)98 %以上。
[0058]三、VEGF多抗的生物素標(biāo)記（其原理如圖1所示，其中，1為N-羥基琥珀酰亞胺生物 素(NHSB)，2為解離的N-羥基琥珀酰亞胺，3為具有伯胺的分子，4為被標(biāo)記生物素的分子）
[0059] 1)將待生物素化的蛋白質(zhì)用0. lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0)或0.5mol/L硼酸 緩沖液(pH 8.6)稀釋到111^/1]1匕
[0060] 2)交互用0· lmol/L碳酸氫鈉緩沖液(pH 8.0)或0.5mol/L硼酸緩沖液(pH 8.6)，對(duì) 抗體溶液充分透析；
[0061 ] 3)用lmLDMSO溶解NHSB lmg;向lmL抗體溶液（即含抗體lmg)加入120ul NHSB溶液 (即含NHSB 120ug);在室溫下持續(xù)攪拌，保溫2-4小時(shí)；
[0062] 4)加入9.6ul lmol/L NH4C1(每25ug NHSB加 luL)，在室溫下攪拌 10分鐘；
[0063] 5)在4°C，對(duì)PBS充分透析，以除去游離的生物素；
[0064] 6)將樣品上lmL的分子篩柱，以PBS緩慢洗脫，收集lmL/管，抗體在1 -3mL之間洗下；
[0065] 7)最后，樣品加入疊氮鈉(終濃度0.5g/L)及1.0g/L BSA。將結(jié)合產(chǎn)物置4°C，避光 保存，亦可加入50 %重蒸甘油，置_20°C保存。
[0066]四、量子點(diǎn)的鏈霉親和素標(biāo)記
[0067] 1)量子點(diǎn)的制備：用lmol/L NaOH溶液將含有巰基丙酸(為穩(wěn)定劑）的CdCl2溶液的 pH值調(diào)節(jié)為11.2，用高純N2將溶液在密閉體系中脫氧、保護(hù)。在適當(dāng)?shù)臄嚢杷俣认拢蛉芤?中加入新制備的無氧NaHTe溶液(通過Te粉和硼氫化鈉反應(yīng)制備），將反應(yīng)液加熱到96°C，回 流2小時(shí)，即可得到尺度較為均一的CdTe納米粒子溶液，無需進(jìn)行尺度分離（（試驗(yàn)中比例為 Cd: Te:巰基丙酸= 1:0.5:2.4)) <XdCl2溶液中CdCl2 · 2.5H20含量為lOmmol;加入巰基丙酸 的量為:添加巰基丙酸至溶液呈乳白色。
[0068] 2)鏈霉親和素(SA)標(biāo)記:在磷酸緩沖液(PBS 0. lmo 1/L，pH= 8.5)中，將水溶性的 表面包覆巰基乙酸的CdTe納米粒子0.6mg和250uL 8.7g/L EDC混合，并向其加入0.12mg的 鏈霉親和素（SA)，室溫下攪拌反應(yīng)3h后，上Sephadex G 100層析柱，用roS(0.1mol/L，pH = 7.4)洗脫，分離純化得到量子點(diǎn)標(biāo)記的鏈霉親和素(QDs-SA)。
[0069] 3)活性檢測(cè):利用繪制SA和包被于磁性粒子上的SA對(duì)B-HRP的競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線方法。 具體步驟如下：
[0070] a制備不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)SA溶液，其濃度梯度為12 ·0、6·0、3·0、1·0、0· 5和0 · 25mg/L;
[0071] b將50L不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)SA溶液和30L包被SA的磁性粒子混合，加入50L B-HRP，在 搖床上25°C反應(yīng)30min，SA和磁性粒子上的SA競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合B-HRP，用PBS洗滌液洗3次；
[0072] c加入 100 LTMB和 100L Η202(0·03%)，室溫下顯色反應(yīng) 10min，再加入 100L lmol/ L H2S〇4終止反應(yīng)；
[0073] d外加磁場(chǎng)分離，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定上清液450nm處的吸光值，并繪制吸光 A450對(duì)標(biāo)準(zhǔn)SA液的質(zhì)量濃度曲線，即為SA和包被于磁性粒子上的SA對(duì)BHRP的競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn) 曲線；
[0074] e將上述制備的QDs-SA標(biāo)記溶液用PBS倍比稀釋，分別取50ul用上述同樣的方法測(cè) 定0D值，并根據(jù)測(cè)得的吸光值(A450)從上面得到的競(jìng)爭(zhēng)抑制標(biāo)準(zhǔn)曲線上，計(jì)算量子點(diǎn)上連 接SA的量。
[0075] 實(shí)施例2
[0076]本實(shí)施例的基于量子點(diǎn)CdTe檢測(cè)人血清中VEGF濃度的試劑盒的使用方法包括以 下步驟：
[0077] 一、VEGF單抗的包被:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的單抗包被濃度，將單抗用包被液稀釋至合 適濃度;200ul/孔加入到反應(yīng)孔中，4°C放置保存20h。用TOST洗板一次，200ul/孔加入封閉 保護(hù)液進(jìn)行封閉，避光室溫放置3h。風(fēng)干后用于樣品檢測(cè)。
[0078] 二、加樣：以VEGF凍干品為標(biāo)準(zhǔn)品，用樣品稀釋液進(jìn)行梯度稀釋為：800pg/mL、 400pg/mL、200pg/mL、100pg/mL、50pg/mL、25pg/mL、12 · 5pg/mL、6 · 25pg/mL;以樣品稀釋液為 陰性對(duì)照；將待檢樣品、標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液及樣品稀釋液200ul/孔加入到反應(yīng)孔中，37°C溫育 lh，VEGF與包被單抗結(jié)合形成抗體-抗原復(fù)合物;用PBST洗板五次。
[0079]三、加生物素標(biāo)記的VEGF抗體:根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定的標(biāo)記抗體的稀釋度進(jìn)行稀釋； 200ul/孔加入到洗好的反應(yīng)孔內(nèi)，37°C溫育30min，標(biāo)記抗體與VEGF結(jié)合，形成抗體-抗原- 抗體夾心復(fù)合物；用PBST洗板五次。
[0080]四、顯色:200ul/孔向反應(yīng)孔中加入鏈霉親和素標(biāo)記的量子點(diǎn)CdTe溶液，37°C溫育 30min，用PBST洗板五次。
[0081]五、檢測(cè)：利用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)量子點(diǎn)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長：430nm;發(fā)射波長： 545nm，通過與標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)比計(jì)算得到樣品中VEGF濃度。
[0082]六、分析性能和穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：
[0083] 1、外觀:微孔板完整、清潔，無異物污染，液體組分應(yīng)澄清，無沉淀或絮狀物。
[0084] 2、最低檢出限:VEGF標(biāo)準(zhǔn)品的最低檢出限<6.25pg/mL。
[0085] 3、精密性:批內(nèi)精密性CV( % )不高于10% (η 2 20)，批間精密性CV( % )不高于10% (n> 10)〇
[0086] 4、準(zhǔn)確性：回收率大于90%~110%之間。
[0087] 5、線性范圍：在(6.25~800)pg/ml線性范圍內(nèi)，依據(jù)校準(zhǔn)品各測(cè)量熒光值與濃度 擬合雙對(duì)數(shù)直線回歸方程，r 2 0.9900。
[0088] 6、穩(wěn)定性:2~8°C儲(chǔ)存，有效期為12個(gè)月。
[0089] 7、特異性：加入20ug/mL的人成纖維細(xì)胞生長因子2(FGF2)和30ng/mL表皮生長因 子(EGF)，測(cè)定結(jié)果< 50pg/ml。
[0090] 實(shí)驗(yàn)例3
[0091]本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心量子點(diǎn)（QDs)法實(shí)驗(yàn)原理，在微孔包被板中預(yù)包被血管內(nèi) 皮生長因子單克隆抗體，加入標(biāo)記抗體（生物素標(biāo)記的VEGF抗體和鏈霉未）和量子點(diǎn)溶液 (鏈霉親和素標(biāo)記的量子點(diǎn)CdTe溶液），利用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)熒光強(qiáng)度，從而確定血管內(nèi)皮 生長因子(VEGF)的濃度。
[0092] 1、選擇637例臨床實(shí)驗(yàn)樣本，其中腎癌56例、胰腺癌56例、子宮內(nèi)膜癌51例、膀胱癌 64例、白血病40例、腦部腫瘤38例、結(jié)直腸癌52例、前列腺癌32例、宮頸癌27例、甲狀腺癌17 例、卵巢癌21例、膽管癌3例、膽囊癌2例、食管癌10例、惡性滋養(yǎng)細(xì)胞瘤5例、淋巴瘤3例、多發(fā) 性骨髓瘤8例、骨癌3例、脊柱癌2例、喉癌2例、絨毛膜上皮癌3例、葡萄胎3例、牙齦癌2例、胸 腺癌2例、嗜鉻細(xì)胞瘤1例、輸尿管癌1例、肝血管內(nèi)皮瘤1例、鼻腔、鼻竇惡性腫瘤1例;正常人 125例，排除女性月經(jīng)期、溶血、黃疸、血脂高、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病、銀肩病、創(chuàng) 傷、心肌梗死及其它心臟疾病、血管炎、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、結(jié)節(jié)病、慢性腎炎、 腎血管疾病等，共計(jì)637例。