檢測呼吸道病毒抗原的蛋白質(zhì)芯片及試劑盒及制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物芯片技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及檢測呼吸道病毒抗原的蛋白質(zhì)芯片及試劑盒及制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002]呼吸道病毒是人類呼吸道感染的病原體，是最常見的傳染病之一。據(jù)世界衛(wèi)生組織統(tǒng)計(jì)，當(dāng)今傳染病占全球死亡人數(shù)之首，大多數(shù)發(fā)展中國家尤為明顯。21世紀(jì)又回到與傳染病做斗爭的時代。感染人類最常見的呼吸道病毒有腺病毒(ADV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、流感病毒(IFV-A、IFV-B)和副流感病毒(PIV)，這些是上呼吸道感染的常見病原體。其感染部位都在同一部位，且反復(fù)感染，癥狀極為相似，難以鑒別。其余如SARS病毒、禽流感病毒(H5N1)、甲型HlNl流感病毒也時而散發(fā)性或大規(guī)模區(qū)域性爆發(fā)流行，是對人類威脅和傳播最快的病原體，死亡率極高?？刂坪丸b別傳染病病原不但是疾病診斷和治療的先決條件，也是生物反恐的需要。這些烈性的呼吸道病毒感染后的癥狀和普通呼吸道病毒基本相似，不通過實(shí)驗(yàn)室檢查無法區(qū)別。
[0003]SARS病毒是冠狀病毒的一個變種，是引起非典型肺炎的病原體。變種冠狀病毒與流感病毒具有親緣關(guān)系，但它是非常獨(dú)特的一種冠狀病毒，在2002年冬到2003年春肆虐全球的嚴(yán)重急性呼吸綜合征(SARS、傳染性非典型肺炎)的元兇就是這種冠狀病毒。SARS病毒在世界各地極為普遍。大約有15種不同冠狀病毒株被發(fā)現(xiàn)，能夠感染多種哺乳動物和鳥類，有些可使人發(fā)病。SARS病毒引起的人類疾病主要是呼吸系統(tǒng)感染(包括嚴(yán)重急性呼吸綜合癥)。該病毒對溫度很敏感，在33°C時生長良好，但35°C就使之受到抑制。由于這個特性，冬季和早春是該病毒疾病的流行季節(jié)。SARS病毒是成人普通感冒的主要病原之一，兒童感染率較高，主要是上呼吸道感染，一般很少波及下呼吸道。另外，還可引起嬰兒和新生兒急性腸胃炎，主要癥狀是水樣大便、發(fā)熱、嘔吐，每天可拉10余次，嚴(yán)重者甚至出現(xiàn)血水樣便，極少數(shù)情況下也引起神經(jīng)系統(tǒng)綜合征。
[0004]禽流感病毒(AIV)屬甲型流感病毒。流感病毒屬于RNA病毒的正黏病毒科，分甲、乙、丙3個型。其中甲型流感病毒多發(fā)于禽類，一些甲型也可感染豬、馬、海豹和鯨等各種哺乳動物及人類；乙型和丙型流感病毒則分別見于海豹和豬的感染。禽類的病毒性流行性感冒，是由A型流感病毒引起禽類的一種從呼吸系統(tǒng)到嚴(yán)重全身敗血癥等多種癥狀的傳染病。禽流感容易在鳥類間流行，過去在民間稱為“雞痕”，國際獸疫局將其定為甲類傳染病。禽流感1994年、1997年、1999年和2003年分別在澳大利亞、意大利、中國香港、荷蘭等地暴發(fā)，2005年則主要在東南亞和歐洲暴發(fā)。感染人的禽流感病毒亞型主要為!15【、!19吧、!17階，其中感染H5N1的患者病情重，病死率高。
[0005]甲型HlNl病毒屬于正粘病毒科(Orthomy X oviridae)，甲型流感病毒屬(Influenza virus A)，其遺傳物質(zhì)為RNA。典型病毒顆粒呈球狀，直徑為80 nm?120 nm，有囊膜。囊膜上有許多放射狀排列的突起糖蛋白，分別是血凝素HA、神經(jīng)氨酸酶NA和M2蛋白。病毒顆粒內(nèi)為核衣殼，呈螺旋狀對稱，直徑為10nm。豬流感病毒為單股負(fù)鏈RNA病毒，基因組約為13.6 kb，由大小不等的8個獨(dú)立片段組成。盡管不同亞型之間可以組成很多種流感病毒血清型，但是可造成人感染豬流感病毒的血清型主要有HlNl、H1N2和H3N2。甲型HlNl流感病毒是A型流感病毒，攜帶有HlNl亞型豬流感病毒毒株，包含有禽流感、豬流感和人流感三種流感病毒的核糖核酸基因片斷，同時擁有亞洲豬流感和非洲豬流感病毒特征。
[0006]目前呼吸道病毒感染的診斷方法主要有:病毒的分離培養(yǎng)、血清學(xué)方法、病毒抗原檢測和核酸檢測(PCR)。分離培養(yǎng)法是在患者的分泌物標(biāo)本中培養(yǎng)出呼吸道病毒，是最基本也是診斷病毒性疾病的金標(biāo)準(zhǔn)。培養(yǎng)所用的標(biāo)本主要為鼻咽部分泌物。由于培養(yǎng)的方法受到抗生素應(yīng)用的影響，陽性率大大降低，而且培養(yǎng)的方法至少經(jīng)過3?5 d甚至兩周才能得到結(jié)果，不能及時為正確合理的治療方案提供依據(jù)。血清學(xué)方法主要為檢測血清中的特異性抗體，尤其是IgM抗體。雖然簡單快速，但其假陽性相對比較高，在抗體產(chǎn)生之前，檢測結(jié)果往往是陰性，對感染窗口期的患者無法做出診斷。尤其是急性感染如SARS、甲型HlNl等屬于急性爆發(fā)性的發(fā)病，易于延誤時間。
[0007]呼吸道病毒抗原的檢測最常用的是免疫熒光法，是除過病毒培養(yǎng)外，比較經(jīng)典的方法。利用呼吸道分泌物來檢測病毒抗原的存在。和病毒培養(yǎng)技術(shù)一樣，可以起到確診的作用。盡管其陽性率也有局限性，但特異性比較高。PCR，檢測標(biāo)本中的病毒核酸，是從核酸水平來診斷呼吸道病毒感染。但目前市面上此類產(chǎn)品不多，而且PCR方法容易引起污染，對使用單位的要求盒實(shí)驗(yàn)室硬件要求較高，只在科研條件下使用。
[0008]綜上所述，上述方法都各有優(yōu)缺點(diǎn)，但都需要一次實(shí)驗(yàn)只能檢測一種病毒，或者一個抗體，不能同時檢測出上述8種病毒。在檢測效率方面費(fèi)時費(fèi)力，分離培養(yǎng)需要3-5天時間。PCR方法固然敏感和特異，但也要幾個小時且不常用，也需要昂貴儀器，一次實(shí)驗(yàn)只能作出一種病毒的診斷，在基層醫(yī)療機(jī)構(gòu)無法實(shí)施，因?yàn)樗枰袊?yán)格控制的操作空間和結(jié)凈環(huán)境。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]針對以上技術(shù)問題，本發(fā)明公開了檢測呼吸道病毒抗原的蛋白質(zhì)芯片及試劑盒及制備方法，實(shí)現(xiàn)用一次實(shí)驗(yàn)即可同時檢測8種以及更多品種的病毒感染的診斷，提高應(yīng)對呼吸道病毒性傳染病診斷的效率和協(xié)助生物反恐甄別。
[0010]對此，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為:
一種檢測呼吸道病毒抗原的蛋白質(zhì)芯片，包括玻璃基質(zhì)載體和固定在所述玻璃基質(zhì)載體上的質(zhì)控對照孔內(nèi)的質(zhì)控蛋白質(zhì)探針;所述質(zhì)控蛋白質(zhì)包括腺病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、流感A型、B型抗原、副流感病毒抗原、SARS病毒抗原、H5N1抗原和Hl N1-A抗原。
[0011 ]采用此技術(shù)方案，能同時檢測腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感A型、流感B型、副流感病毒、SARS病毒、禽流感病毒(H5N1)和甲型HlNl病毒感染，更加方便快捷，提高應(yīng)對呼吸道病毒性傳染病診斷的效率。
[0012]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述玻璃基質(zhì)載體預(yù)先經(jīng)過醛基或氨基化處理。
[0013]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述質(zhì)控蛋白質(zhì)為基因工程或純化抗原、或合成肽片段。
[0014]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述蛋白質(zhì)芯片的孔位陣列為4X3、4X 4或5 X 5的點(diǎn)陣排布。即所述蛋白質(zhì)芯片的反應(yīng)區(qū)域的陣列為4 X 3、4 X 4或5 X 5的孔位排布。
[0015]優(yōu)選的，在玻璃基質(zhì)載體上用PVC或其他有機(jī)物制成的微孔陣列，與活化載體上的基團(tuán)配套成呼吸道分泌物測定的玻璃基質(zhì)芯片。
[0016]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述玻璃基質(zhì)載體采用以下方法制備得到:
(1)將玻璃基質(zhì)載體用濃硫酸和高錳酸鉀混合液浸泡過夜，水洗后再用氨水浸泡過夜；水洗后再用濃鹽酸浸泡，取出后水洗干凈后烤干；
(2)將烤干的玻璃基質(zhì)載體浸泡在氨化液中氨化I小時，取出后水洗烤干;再浸泡在醛基溶液中浸泡I小時，取出后水洗烤干待用。
[0017]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述氨水的濃度為氨:水=1:3的體積比;所述濃鹽酸的濃度為濃HC1: H2O =1:3的體積比;所述醛基溶液為采用5%戊二醛用水配制得到。
[0018]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述質(zhì)控蛋白質(zhì)還包括鼻病毒抗原、柯薩奇病毒抗原、冠狀病毒抗原、偏肺病毒抗原、EB病毒抗原、皰疹病毒6型抗原和或ECHO病毒抗原中的至少一種。采用此技術(shù)方案，可以任意擴(kuò)展需要檢測的品種，滿足更加復(fù)雜的呼吸道感染的病毒性傳染病診斷。
[0019]本發(fā)明還提供了一種如上所述的檢測呼吸道病毒抗原的蛋白質(zhì)芯片的制備方法，包括以下步驟:
步驟A:將玻璃基質(zhì)載體用濃硫酸和高錳酸鉀混合液浸泡過夜，水洗后再用氨水浸泡過夜;水洗后再用濃鹽酸浸泡，取出后水洗干凈后烤干;將烤干的玻璃基質(zhì)載體浸泡在氨化液中氨化I小時，取出后水洗烤干;再浸泡在醛基溶液中浸泡I小時，取出后水洗烤干待用。
[0020]步驟B:將玻璃基質(zhì)載體的1/3區(qū)域設(shè)為標(biāo)識區(qū)，玻璃基質(zhì)載體的2/3區(qū)域設(shè)置成4X 3的微陣列孔陣;并在玻璃基質(zhì)載體上做好標(biāo)識；
步驟C:在玻璃基質(zhì)載體上在玻璃基片上用PVC或其他有機(jī)物制成的微孔陣列，包括三個PC孔和一個NC孔;在三個PC孔內(nèi)用生物芯片點(diǎn)樣儀每孔點(diǎn)8個點(diǎn)，分別是腺病毒抗原、呼吸道合胞病毒抗原、流感A型抗原、B型抗原、副流感病毒抗原、SARS病毒抗原、H5N1抗原和HlNl-A抗原，為質(zhì)控點(diǎn)；
步驟D:在NC孔內(nèi)，用標(biāo)本提取液用生物芯片點(diǎn)樣儀點(diǎn)8個點(diǎn)，為陰性質(zhì)控點(diǎn)；
步驟E:將上述兩個陣列分別封口，加干燥劑裝于鋁箔袋內(nèi)在2-8°C保存?zhèn)溆谩?br>[0021]采用此技術(shù)方案，以玻璃基質(zhì)為載體，經(jīng)過多次處理后使其表面具有活性基團(tuán)如醛基或氨基，再在處理后的玻璃基質(zhì)上覆蓋PVC或其他基膜，這種PVC基膜上預(yù)先設(shè)置成相同孔徑的微陣列狀排列布局，分別標(biāo)明上述8種病毒孔徑所在的位置，將患者分泌物提取物分別固定于上述各孔徑的陣列中，然后通過后續(xù)反應(yīng)，一次實(shí)驗(yàn)即可鑒別是腺病毒、呼吸道合胞病毒、流感A型、流感B型、副流感病毒、SARS病毒、禽流感病毒和甲型HlNl病毒中哪種病毒感染，實(shí)現(xiàn)一次實(shí)驗(yàn)即可鑒別診斷8種病毒感染的目的，尤其上述病毒感染后臨床癥狀幾乎完全相似，只有嚴(yán)格的鑒別診斷才能區(qū)別。對于大規(guī)模爆發(fā)的呼吸道病毒感染及生物反恐有重要意義。
[0022]作為本發(fā)明的進(jìn)一步改進(jìn)，所述玻璃基質(zhì)載體的2/3區(qū)域?yàn)閮山M4X3的微陣列孔陣。
[0023]本發(fā)明還提供了一種檢測呼吸道病毒抗原的蛋白質(zhì)芯片的試劑盒，采用如上所述的檢測呼吸道病毒抗原的蛋白質(zhì)芯片，還包括:
生物素標(biāo)記的特異性抗體，包括含有抗腺病毒、抗呼吸道合胞病毒、抗流感A型、B型病毒、抗副流感病毒、抗SARS病毒、抗禽流感病毒和抗甲型流感病毒;優(yōu)選的，所述生物素標(biāo)記的特異性抗體用稀釋液稀釋后裝于試劑瓶中密封；
鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶；
鏈霉親和素標(biāo)記的堿性磷酸酶或辣根過氧化物酶的特異性底物。
[0024]采用上述方案，檢測結(jié)果可以因酶的底物不同，形成顏色反應(yīng)或發(fā)光反應(yīng)。
[0025]所述的呼吸道病毒抗原