晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞er基因的檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)ER基因的新方法，尤其是通過外周血檢測(cè)晚期乳腺癌患者ER 基因的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]目前作為預(yù)后因子納入治療指南中的雌激素受體(Estrogen receptor，ER)已經(jīng) 成為制定乳腺癌患者內(nèi)分泌治療方案時(shí)最重要的指標(biāo)?，F(xiàn)有的乳腺癌ER的檢測(cè)需要通過手 術(shù)或穿刺活檢等方式獲得原發(fā)瘤或轉(zhuǎn)移瘤的腫瘤組織標(biāo)本，然而不是每一位患者都能獲得 腫瘤組織樣本，而且不能在治療過程中進(jìn)行連續(xù)的檢測(cè)，限制了其成為有效的療效監(jiān)測(cè)指 標(biāo)。但脫落入血的循環(huán)腫瘤細(xì)胞可以給我們提供潛在的實(shí)時(shí)腫瘤標(biāo)本，其突變狀態(tài)同樣可 以用于指導(dǎo)治療。
[0003] 循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating tumor cell，CTC)是從實(shí)體腫瘤脫落而進(jìn)入外周血 液循環(huán)的腫瘤細(xì)胞，它存在于乳腺癌、前列腺癌、結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤中，其檢測(cè)對(duì)于 評(píng)估腫瘤患者尤其是晚期腫瘤患者的預(yù)后以及選擇合適的個(gè)體化治療具有重要的臨床意 義。因 CTC檢測(cè)具有微創(chuàng)、實(shí)時(shí)等特點(diǎn)，被稱為"液態(tài)活檢"。
[0004] 目前CTCs檢測(cè)的主要方法包括依賴腫瘤相關(guān)標(biāo)志物檢測(cè)的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)及基 于形態(tài)學(xué)富集的膜過濾技術(shù)（Isolating by size of epithelial tumor cells，ISET)。前 者是基于細(xì)胞表面表達(dá)不同抗原標(biāo)志，將針對(duì)腫瘤細(xì)胞表面抗原的特異性抗體EpCAM、CK等 包被于磁珠表面以完成腫瘤細(xì)胞的特異性識(shí)別，借助外加磁場(chǎng)篩選富集CTCs。該技術(shù)的優(yōu) 勢(shì)在于特異度較高，已有商品化的半自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備(CellSearch);但腫瘤特異性抗原表達(dá) 的缺失會(huì)造成假陰性結(jié)果。后者是根據(jù)細(xì)胞大小的差異，利用過濾的方法將體積較大的腫 瘤細(xì)胞篩選富集。該技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于方法簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉，分離獲得的CTCs具有活性可用于 后續(xù)研究;但由于缺乏形態(tài)學(xué)診斷金標(biāo)準(zhǔn)，該富集技術(shù)特異性相對(duì)較差。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服傳統(tǒng)循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測(cè)技術(shù)及晚期乳腺癌患者不適宜組織標(biāo)本取材一 進(jìn)而無法評(píng)估患者ER狀態(tài)的不足，本發(fā)明專利提供一種晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì) 胞ER基因的檢測(cè)方法:利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血中的CTC;利用細(xì)胞 免疫熒光技術(shù)鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞;運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作薄層切 片;進(jìn)而通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情況。
[0006] 該方法具體步驟如下：
[0007] -、利用膜過濾裝置分離獲取晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：
[0008] 1、采集晚期乳腺癌癥患者外周血:肘正中靜脈10ml，均分為2管編寫相同編號(hào)后， 分別命名為實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組；
[0009] 2、將2管外周血樣分別進(jìn)行預(yù)處理：將采集的外周血樣10倍稀釋，稀釋液成分： lmmol/1 EDTA+0.1%BSA，稀釋后用4%多聚甲醛固定外周血樣10分鐘；
[0010] 3、利用膜過濾裝置分離外周血樣，富集外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞:將預(yù)處理的外周血 樣加入到膜過濾裝置的血樣容器中，使其依靠重力自然過濾；
[0011] 4、過濾結(jié)束后，從膜過濾裝置中取下濾器，PBS沖洗2-3次，外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞被 截留在濾膜上。
[0012] 二、利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：
[0013] 1、向?qū)嶒?yàn)1組分離獲取外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的濾器中加入Cytoperm/Cytofix試劑 300μ1，固定、穿孔 15min;
[0014] 2、PBS漂洗3次，每次5分鐘，之后加入washbuffer 300μl，封閉30min;
[0015] 3、加入CK8/18/19、Q)45-抗混懸液300μ1，兩種一抗均以wash buffer稀釋，混勾 后的終濃度為1:250，室溫下孵育45min;
[0016] 4、Wash buffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入二抗混懸液300μ1，兩種二抗均以 wash buffer稀釋，混勾后的終濃度為1:500，室溫下避光孵育30min;
[0017] 5、Wash buffer洗滌3次，每次5分鐘，之后加入Hoechst 300μ1，洗染細(xì)胞核5min; [0018] 6、PBS漂洗2次，每次3分鐘，之后取出濾膜置于載玻片上，滴加10μ1抗熒光淬滅封 閉液封片；
[0019] 7、熒光顯微鏡下2h內(nèi)觀察結(jié)果，拍照、記錄CTC情況，確定是否存在CTC;如觀察到 CTC則繼續(xù)進(jìn)行下一步檢測(cè)，否則停止檢測(cè)。
[0020] 三、運(yùn)用細(xì)胞蠟塊技術(shù)制作CTC細(xì)胞蠟塊：
[0021] 1、從過濾裝置中取下實(shí)驗(yàn)2組相同血樣編號(hào)的濾器，打開并移走濾器上口，將循環(huán) 腫瘤細(xì)胞染色液加入到濾器中，染色2min，PBS緩沖液沖洗干凈，用眼科鑷子取下濾膜，放置 在載玻片上，適當(dāng)干燥后在顯微鏡下觀察，證實(shí)存在CTC;
[0022] 2、制作CTC細(xì)胞蠟塊；
[0023] A、脫色：將上述載玻片上的濾膜取下，置于脫色液中浸泡4-6小時(shí)，脫去CTC染色 液，所述脫色液為:95 %酒精與100 %二甲苯按體積比1:1混勻；
[0024] B、包裹:浸泡結(jié)束后取出濾膜，用吸水紙包裹；
[0025] C、固定:將包裹物置于10%中性福爾馬林中，固定4_6h。
[0026] D、浸蠟包埋：固定結(jié)束后取出包裹物，脫水后置于石蠟包埋盒中，浸蠟包埋制作細(xì) 胞石蠟塊。
[0027] E、薄層切片:用切片機(jī)將細(xì)胞石蠟塊連續(xù)切片，制成厚度為2_4μπι的薄層切片。 [0028]四、通過免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的ER表達(dá)情 況：
[0029] 1.烤片:CTC蠟塊薄層切片在60°C恒溫箱中烤片2小時(shí)；
[0030] 2.脫蠟:切片于兩瓶二甲苯中分別放置5分鐘；
[0031] 3.水化:將切片依次在無水乙醇、95%乙醇、85%乙醇中分別放置1分鐘(視室內(nèi)溫 度情況稍作調(diào)整）：自來水、蒸餾水沖洗；
[0032] 4.抗原修復(fù)：將高壓鍋內(nèi)的修復(fù)液EDTA煮沸，放入切片至完全沒入修復(fù)液蓋上高 壓鍋蓋及壓力閥，加熱至高壓鍋噴氣后1.5分鐘，離火，將高壓鍋稍冷卻打開鍋蓋，切片在修 復(fù)液中自然冷卻；
[0033] 5.蒸餾水沖洗；
[0034] 6.去除內(nèi)源性過氧化物酶:用3 % H202作用切片10分鐘；
[0035] 7.蒸餾水沖洗；
[0036] 8 .PBS浸洗5次各1.5分鐘；
[0037] 9.滴加 ER-抗，4°C冰箱中過夜，然后將其放入PBS浸洗5次，每次浸洗1.5分鐘；
[0038] 10.滴加二抗；
[0039] 11.37°C水浴鍋中孵育20分鐘；
[0040] 12. PBS浸洗5次各1.5分鐘；
[0041 ] 13.顯微鏡下控制，DAB顯色；
[0042] 14.自來水沖洗，蘇木精染液復(fù)染2分鐘，鹽酸酒精分化，氨水返藍(lán)；
[0043] 15.自來水沖洗5分鐘；
[0044] 16.75%-95%-100%梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性快干膠封片；
[0045] 17.細(xì)胞病理學(xué)專家閱片，判讀ER表達(dá)情況。
[0046] 利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞步驟中所述的膜過濾裝置:包括 濾器、血樣容器、廢液缸和鐵架臺(tái)，所述鐵架臺(tái)設(shè)有底座、立架和支架，所述血樣容器通過支 架設(shè)置于鐵架臺(tái)上部，血樣容器的下方為濾器，濾器通過輸液器聯(lián)通至廢液缸，廢液缸設(shè)置 于底座上。
[0047] 所述濾器包括濾器上口、濾膜、載濾膜平臺(tái)和濾器下口，濾膜置于載濾膜平臺(tái)上； 濾器上口接血樣容器，濾器下口通過輸液器接廢液缸。
[0048]所述濾膜為疏水材料制成，其上均勻布滿口徑為10微米的濾孔。
[0049] 有益效果:借助于ISET技術(shù)分離富集CTCs，依靠細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定CTCs，不僅 能夠克服單純ISET技術(shù)鑒定CTCs存在的困難，亦能捕獲上皮抗原表達(dá)減弱或缺失的腫瘤細(xì) 胞，即克服單純免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)存在的假陰性。同時(shí)，該技術(shù)設(shè)備要求不高，方法易于掌握， 并能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)，具有臨床推廣應(yīng)用可能。通過該技術(shù)方法，不用取材乳腺癌組織即可檢測(cè)到 晚期乳腺癌患者ER表達(dá)情況。該技術(shù)屬于微創(chuàng)甚至無創(chuàng)，并能夠?qū)崟r(shí)檢測(cè)。
【附圖說明】
[0050] 圖1為本發(fā)明的膜過濾裝置結(jié)構(gòu)示意圖；
[0051 ]圖2為本發(fā)明膜過濾裝置的濾器的結(jié)構(gòu)示意剖視圖；
[0052] 圖3為本發(fā)明膜過濾裝置的濾器濾膜的結(jié)構(gòu)示意圖；
[0053] 圖4為晚期乳腺癌癌患者外周血分離獲取的循環(huán)腫瘤細(xì)胞影像圖；
[0054]圖5為晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞免疫組化ER染色圖像。
[0055]圖中1.鐵架臺(tái)2.血樣容器3.濾器4.輸液器5.廢液缸6.濾器上口 7.濾膜8. 載濾膜平臺(tái)、9.濾器下口、10.濾孔、11.底座、12.立架、13支架。
【具體實(shí)施方式】
[0056]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說明。
[0057]運(yùn)用此技術(shù)方法分離獲取并鑒定8例晚期乳腺癌癌患者（同時(shí)檢測(cè)8例正常人樣本 做陰性對(duì)照)外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞，檢測(cè)其ER表達(dá)情況。
[0058] 一、利用膜過濾裝置分離獲取無法獲得組織標(biāo)本的晚期乳腺癌患者外周血中的 CTC：
[0059] 采集晚期乳腺癌患者外周血10ml，均分為2管，同一患者血樣編寫相同編號(hào)，分別 命名為實(shí)驗(yàn)1組和實(shí)驗(yàn)2組;然后將2管外周血樣分別進(jìn)行預(yù)處理:將采集的外周血樣10倍稀 釋，稀釋液成分：lmm〇l/l EDTA+0.1%BSA)，稀釋后用4%多聚甲醛固定外周血樣10分鐘;在 固定的間期，組裝膜過濾分離腫瘤細(xì)胞(ISET)簡(jiǎn)易裝置(如圖1、2、3所示）：該過濾裝置由濾 器3、濾膜7、血樣容器2、廢液缸5、鐵架臺(tái)1構(gòu)成，利用膜過濾裝置分離外周血樣，富集外周血 循環(huán)腫瘤細(xì)胞：用lOmlPBS潤(rùn)濕濾器3,然后將預(yù)處理的外周血樣加入到膜過濾裝置的血樣 容器2中，使其依靠重力自然過濾;過濾結(jié)束后，從膜過濾裝置中取下濾器3，PBS沖洗2-3次， 外周血CTC被截留在濾膜7上。
[0060] 腫瘤細(xì)胞直徑一般大于15微米，而血細(xì)胞(包括紅細(xì)胞、白細(xì)胞)直徑一般小于10 微米，因此當(dāng)含有CTC的外周血經(jīng)過濾后，血細(xì)胞因直徑小于濾孔10能夠被濾過，而CTC因直 徑大于濾孔10被截留在濾膜7上。
[0061] 二、利用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)鑒定晚期乳腺癌患者外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞：
[0062]向分離獲取外周血循環(huán)腫瘤細(xì)胞的濾器3中（實(shí)驗(yàn)1組)加入Cyt