液相芯片法hiv抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于免疫測(cè)定法領(lǐng)域，具體是一種液相忍片法HIV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑 盒及檢測(cè)方法。
【背景技術(shù)】
[0002] HIV感染檢測(cè)包括P24抗原、HIV抗體、HIV病毒載量、CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)等方法。目前臨床 進(jìn)行HIV血液篩查最常用的方法為酶聯(lián)免疫吸附法化LISA) dHIV ELISA試劑到目前為止已 經(jīng)發(fā)展到了第4代。目前國(guó)際和國(guó)內(nèi)HIV檢測(cè)的主流試劑和方法是第3代試劑，雙抗原夾屯、法 檢測(cè)標(biāo)本中的抗體，酶標(biāo)記物是特異性HIV抗原，可檢測(cè)HIV不同的抗體亞型HIV-1/2/0 IgG/M/A，其檢測(cè)的靈敏度和特異性高于第1、2代試劑，改善了0群標(biāo)本的反應(yīng)性，窗口期縮 短至22天。
[0003] 目前國(guó)際上有3種HIV-I確認(rèn)實(shí)驗(yàn)方法，包括免疫印跡實(shí)驗(yàn)、免疫巧光實(shí)驗(yàn)和條帶 免疫試驗(yàn)。衛(wèi)生部頒布的《艾滋病檢測(cè)技術(shù)規(guī)范》中規(guī)定我國(guó)HIV感染唯一的確認(rèn)方法為免 疫印跡實(shí)驗(yàn)(WB)，也是證實(shí)HIV感染的最特異、最敏感的方法。WB是將HIV全病毒抗原經(jīng)SDS-PAGE，把分子量大小不同的蛋白條帶分開，然后再將運(yùn)些不同分子量大小的蛋白電轉(zhuǎn)到硝 酸纖維素膜上，再將該膜切割成條帶狀使每條硝酸纖維素膜上均含有經(jīng)SDS-PAGE分離過(guò)的 HIV抗原。加入經(jīng)緩沖液稀釋的血清標(biāo)本，若血清標(biāo)本中含有HIV抗體，顯色反應(yīng)之后將會(huì)在 硝酸纖維素膜的相應(yīng)位置顯現(xiàn)出肉眼可見的條帶。HIV免疫印跡實(shí)驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)為:形成至少 兩條Env帶(gp41、即120/即160)或者一條Env帶加上p24帶結(jié)果判定為陽(yáng)性，出現(xiàn)帶型不能 滿足陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)結(jié)果判定為可疑，無(wú)任何HIV條帶形成結(jié)果判定為陰性，能夠鑒別初篩實(shí) 驗(yàn)的假陽(yáng)性結(jié)果；在HIV病程的早期或晚期p31帶常常缺失，可作為HIV病程的一個(gè)預(yù)測(cè)指 標(biāo)。但是HIV免疫印跡實(shí)驗(yàn)有2%的假陽(yáng)性率，大多見于有疫苗接種史和患有自身免疫性疾病 的患者。若將酶聯(lián)免疫實(shí)驗(yàn)和免疫印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)合起來(lái)檢測(cè)HIV抗體，可W大大提高HIV抗體 的檢出率(約99%)，假陽(yáng)性率降低至0.0006。雖然WB基于HIV不同抗原組分的分離、濃縮及純 化具有較高的特異性，但是WB和化ISA及其他檢測(cè)方法相比檢測(cè)成本高、實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求嚴(yán) 格、影響因素較多，誤判帶型W及操作不當(dāng)?shù)募訇?yáng)性率超過(guò)2%，初復(fù)檢HIV陽(yáng)性的4%-20%的 樣品WB的檢測(cè)結(jié)果為"抗體不確定"，一部分HIV抗體不確定標(biāo)本與p24帶有關(guān)系，運(yùn)可能與 非特異性抗體有關(guān)。不確定的標(biāo)本需3、6個(gè)月隨訪后方能確定，使無(wú)償獻(xiàn)血者個(gè)人、家庭、工 作和生活承受巨大的壓力，也給工作人員帶來(lái)諸多不便。
[0004] 被譽(yù)為后基因組時(shí)代忍片技術(shù)的液相忍片技術(shù)是20世紀(jì)90年代中期發(fā)展起來(lái)的， 液相忍片技術(shù)又稱懸浮忍片技術(shù)、多功能懸浮點(diǎn)陣技術(shù)（Multi-Analyte Suspension Array，MASA)、Luminex技術(shù)或者是xMAP(flexible multiple-analyte profiling)技術(shù)。 液相忍片技術(shù)采用直徑為5.6um的聚丙乙締微球作為檢測(cè)載體，每個(gè)微球用紅色和澄色兩 種巧光染料進(jìn)行編碼，通過(guò)調(diào)整運(yùn)兩種巧光染料的比例能夠獲得100中不同巧光染色的微 球。當(dāng)微球被635nm的激光照射后，微球能發(fā)射出658nm和71化m的巧光。每種微球的地址是 由兩種巧光染料的比例唯一決定的，將每種編碼微球共價(jià)偶聯(lián)捕獲分子運(yùn)樣每種編碼微球 都有其對(duì)應(yīng)的檢測(cè)項(xiàng)目，進(jìn)行檢測(cè)時(shí)將進(jìn)行不同待測(cè)物的微球與待測(cè)樣本混合形成微球-捕獲分子-待測(cè)物的混合物，最后加入鏈霉親和素藻紅蛋白（S化epavidin-phycoeiTt虹in, SA-PE)作為報(bào)告分子與混合物特異性結(jié)合，在一個(gè)反應(yīng)相內(nèi)最多可檢測(cè)100種反應(yīng)。新的 Luminex液相忍片系統(tǒng)采取=種巧光物質(zhì)，通過(guò)調(diào)整=種巧光染料的比例，可W將微球分為 500 種。
[000引 Luminex-lOO/200/xMAP檢測(cè)時(shí)，儀器抽取反應(yīng)樣品通過(guò)紅色激光激發(fā)微球內(nèi)部的 兩種/ =種巧光物質(zhì)信號(hào)接收器接收巧光信號(hào)，區(qū)分微球編號(hào)，確定微球上的捕獲分子;綠 色巧光激發(fā)結(jié)合微球上的報(bào)道分子(藻紅蛋白），結(jié)合的越多巧光信號(hào)越強(qiáng)，結(jié)果通過(guò)平均 巧光強(qiáng)度(Mean Fluorescent Intensity,MFI)判斷。微球的信號(hào)和藻紅蛋白信號(hào)同時(shí)被機(jī) 器識(shí)別，系統(tǒng)才認(rèn)為是有效信號(hào)，運(yùn)樣就避免了其他物質(zhì)的干擾提高了實(shí)驗(yàn)的特異性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明就是為了克服HIV第S代試劑假陽(yáng)性率高及WB檢測(cè)的局限性的問(wèn)題，所提 出的一種液相忍片法HIV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒及檢測(cè)方法。
[0007] 本發(fā)明是按照W下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的。
[0008] 一種液相忍片法HIV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒，包括由HIV抗原gp41、pl7、p24、 p31、p66、gpl20分別包被的微球，生物素化抗人二抗，SA-陽(yáng)溶液;p24單克隆抗體包被的微 球，巧光素標(biāo)記的與p24單克隆抗體配對(duì)的單克隆抗體。
[0009] 任一的所述HIV抗原甜41、pl7、p24、p31、p66、gpl20和p24單克隆抗體與微球的包 被比例為2-加 g的抗原或抗體包被1 X IO6個(gè)微球。
[0010] 所述生物素化抗人二抗為生物素化羊抗人抗體，生物素化抗人二抗?jié)舛葹?-8ug/ mlo
[0011] 所述與p24單克隆抗體配對(duì)的單克隆抗體為RDl標(biāo)記的抗p24 KC57抗體;巧光素標(biāo) 記的與p24單克隆抗體配對(duì)的單克隆抗體的濃度為0.5-lug/ml。
[001引所述SA-PE溶液的濃度為13-1加 g/ml;加入SA-PE溶液的反應(yīng)時(shí)間為20-30min。
[0013] -種液相忍片法HIV抗原抗體聯(lián)合檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)方法 (1) 檢測(cè)抗體:將抗原包被的微球與樣本反應(yīng)40-60min，再加入4-8ug/ml的生物素化抗 人二抗反應(yīng)30-40min，最后加入13-1加 g/ml的SA-陽(yáng)溶液反應(yīng)20-30min，然后進(jìn)行儀器檢 測(cè)軟件分析； (2) 檢測(cè)抗原:將p24單克隆抗體包被的微球與樣本反應(yīng)40-60min，再加入0.5-lug/ml 的與p24單克隆抗體配對(duì)的單克隆抗體解育40-60min，最后進(jìn)行儀器檢測(cè)軟件分析。
[0014] 每Iul樣本加入4-8個(gè)抗原包被的微球進(jìn)行反應(yīng)。
[0015] 每Iul樣本加入4-8個(gè)p24單克隆抗體包被的微球進(jìn)行反應(yīng)。
[0016] 本發(fā)明獲得了如下有益效果。
[0017] 本發(fā)明僅需少量樣本即可同時(shí)對(duì)HIV 6種抗體和P24抗原進(jìn)行組合檢測(cè)。并且本發(fā) 明與免疫印跡法相比具有很高的靈敏度和特異性:載體微球表面積大，每個(gè)微球上可包被 100 000個(gè)捕獲抗體/抗原，如此高密度的捕獲抗體/抗原保證了能夠最大程度地與樣本中 的抗原/抗體分子結(jié)合，提高檢測(cè)靈敏度。本發(fā)明可在感染早期及時(shí)檢出HIV抗體，實(shí)現(xiàn)HIV 感染的早發(fā)現(xiàn)、早干預(yù)，減少HIV傳播，保證輸血安全，具有廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說(shuō)明】
[001引圖1是本發(fā)明口31、口24、口17、口66四種蛋白505斗466電泳圖； 圖2是本發(fā)明生物素化二抗?jié)舛葘?duì)MFI的影響圖； 圖3是本發(fā)明SA-陽(yáng)加入濃度對(duì)MFI的影響圖； 圖4是本發(fā)明SA-PE反應(yīng)時(shí)間對(duì)MFI的影響圖； 圖5是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)加樣方式對(duì)MFI的影響圖。
【具體實(shí)施方式】
[0019]下面結(jié)合附圖及實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0020] 1.甜17，p31, p66, p24表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定(抗原甜120、即41由萬(wàn)泰生物藥 業(yè)股份有限公司合成） 1.1目的片段的擴(kuò)增
參照NCBI上的HIV-I CRFOl-AE亞型甜 17，p31, p66, p24(Taxonomy ID: 471721)基 因全長(zhǎng)，參考相關(guān)文獻(xiàn)應(yīng)用分析軟件Primer 5設(shè)計(jì)引物，P24上游引入Nde I酶切位點(diǎn)同時(shí) 引入起始密碼子ATG，下游引入Bam HI酶切位點(diǎn)。P17、P31、P66上游引入Bam HI酶切位點(diǎn)，下 游引入化nd III酶切位點(diǎn)。各引物序列如下所示:（引物由英濰捷基貿(mào)易有限公司合成） P24 上游： 下游： P17 上游： 下游： P31 上游： 下游： P66 上游： 下游： Whiv-I中國(guó)流行株CRFOl-AE基因 （Taxonomy ID: 471721)全長(zhǎng)為模板在GeneAmp PCR system 9700 PCR儀（美國(guó)陽(yáng)公司）上根據(jù)寶生物工程有限公司Pyrobest DNA Polymerase 試劑說(shuō)明書配制PCR反應(yīng)體系，如下所示： IOXPyrobest Buffer II (Mg^^ Plus) 5ul dNTP MixUire (各2.5mM) 4ul 上游引物（20 uM) Iul 上游引物（20 uM) Iul