一種均相定量比較未純化酶及其突變體比活性的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于酶生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及酶比活性的測定和定量比較，適用于篩選酶突變體庫、快速確認(rèn)陽性突變體、快速測定比活性進(jìn)行比較研究酶序列結(jié)構(gòu)和活性關(guān)系。
【背景技術(shù)】
[0002]酶是重要的生物技術(shù)產(chǎn)品，其應(yīng)用都需酶比活性盡可能高，否則應(yīng)用成本很高甚至不能應(yīng)用，如免疫分析標(biāo)記酶比活性太低則因其靈敏度太低而不能用。為提高酶比活性需要進(jìn)行酶分子工程，即通過合理設(shè)計(jì)改變酶蛋白的氨基酸序列，或者隨機(jī)改變酶蛋白的氨基酸序列，在進(jìn)行重組表達(dá)后測定比活性進(jìn)行篩選實(shí)現(xiàn)定向進(jìn)化。不論用哪種策略進(jìn)行酶分子工程，或者研究酶的氨基酸序列和活性的關(guān)系，都需快速測定大量酶突變體的比活性進(jìn)行定量比較。傳統(tǒng)方法測定酶及其突變體比活性時(shí)需重組表達(dá)后逐個(gè)純化再測定蛋白量和活性計(jì)算比活性，其效率低且成本高;對(duì)于難以純化的酶及其突變體，其花費(fèi)和時(shí)間更難承受。
[0003]通過receiver-operator-curve (ROC)分析考察用特定的酶活性指標(biāo)定性識(shí)別陽性突變體的曲線下面積(&^&-1111(161-(3111^，41]0，是衡量識(shí)別可靠性的定量指標(biāo)。測定誘導(dǎo)表達(dá)后細(xì)胞裂解液中酶活性很容易，但目標(biāo)酶蛋白誘導(dǎo)表達(dá)豐度變異大，用于識(shí)別比活性提高I倍陽性突變體的AUC通常不超過0.82。測定細(xì)胞裂解液中總蛋白濃度計(jì)算表觀比活性，用于識(shí)別比活性提高I倍陽性突變體的AUC也很難超過0.90。理論上，選擇性測定細(xì)胞裂解液中目標(biāo)酶的蛋白量或針對(duì)相同參考品的相對(duì)量計(jì)算出其(相對(duì))比活性用于比較，只要測定活性和目標(biāo)酶蛋白量的精度足夠高，用于識(shí)別比活性提高I倍陽性突變體的AUC有望超過0.98。
[0004]免疫學(xué)方法能選擇性測定混合物中特定蛋白含量。為低成本和高效率，需快速測定每個(gè)突變體數(shù)個(gè)單克隆的細(xì)胞裂解液中目標(biāo)酶蛋白量計(jì)算比活性進(jìn)行比較識(shí)別陽性突變體，這就要求精度高且效率高的均相免疫分析方法。免疫比濁法就屬于均相分析方法，其用多抗作為試劑故成本低;所測信號(hào)對(duì)反應(yīng)體系中目標(biāo)酶的濃度接近線性響應(yīng)，保障了數(shù)據(jù)換算的精度高。但免疫比濁法測定范圍窄且靈敏度較低。優(yōu)化誘導(dǎo)表達(dá)過程提高目標(biāo)酶在細(xì)胞中表達(dá)豐度、調(diào)整加樣量重新測定，有望用免疫比濁法測定細(xì)胞裂解液中目標(biāo)酶蛋白量;用非線性響應(yīng)曲線擬合計(jì)算目標(biāo)酶蛋白量也能拓寬測量范圍。酶蛋白多抗易于制備。所以，用免疫比濁法測定細(xì)胞裂解液中目標(biāo)酶蛋白量，有望解決識(shí)別陽性突變體的問題且通用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]1.—種均相定量比較未純化酶及其突變體比活性的方法，其特征在于:
[0006](— )擬定量比較比活性的酶及其突變體合稱目標(biāo)酶;其中，所述酶為起始酶，其余突變體來自該起始酶的定點(diǎn)突變、隨機(jī)單位點(diǎn)突變或隨機(jī)多位點(diǎn)突變，且目標(biāo)酶在原核或真核宿主細(xì)胞中能直接可溶性活性表達(dá)，或與增溶標(biāo)簽后融合后在原核能可溶性活性表達(dá)；
[0007](二)通過如下的步驟，均相定量比較未純化酶及其突變體比活性:
[0008](I)制備針對(duì)目標(biāo)酶的多抗:選需要定量比較比活性的起始酶或某個(gè)突變體，重組表達(dá)后純化到70%以上純度作為免疫原；選體重在0.2kg以上哺乳動(dòng)物，包括但不限于兔子、豚鼠和羊，用所選免疫原對(duì)該哺乳動(dòng)物進(jìn)行多次免疫;首次免疫用弗氏完全佐劑，此后用弗氏不完全佐劑，相鄰兩次免疫的間隔長于I周天但短于4周，合計(jì)免疫3次以上;免疫次數(shù)達(dá)到要求后，收集被免疫哺乳動(dòng)物的血清作為抗血清，用0.22μπι濾膜過濾的濾液為所需多抗；
[0009](2)重組表達(dá)目標(biāo)酶:以可溶性活性表達(dá)為前提選擇重組表達(dá)所需宿主細(xì)胞和表達(dá)載體;難以在原核直接可溶活性表達(dá)的真核酶蛋白，用增溶標(biāo)簽在原核宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行融合表達(dá);所有目標(biāo)酶用相同宿主細(xì)胞和表達(dá)載體進(jìn)行重組表達(dá)，優(yōu)化條件使表達(dá)效率滿足如下要求:
[0010](a)如宿主細(xì)胞中沒有與目標(biāo)酶催化活性相同的可溶性內(nèi)源性酶，要求重組表達(dá)后在細(xì)胞內(nèi)所有可溶性蛋白中，目標(biāo)酶蛋白的百分含量即豐度不低于I % ;
[0011](b)如宿主細(xì)胞中有與目標(biāo)酶催化活性相同的可溶性內(nèi)源性酶，要求重組表達(dá)后在細(xì)胞內(nèi)所有可溶性蛋白中，目標(biāo)酶蛋白的豐度不低于相同催化活性可溶性內(nèi)源性酶的20倍；
[0012](C)如宿主細(xì)胞中有與目標(biāo)酶催化活性相同的部分可溶性內(nèi)源性酶，要求重組表達(dá)后在細(xì)胞內(nèi)所有可溶性蛋白中，目標(biāo)酶蛋白的豐度不低于相同催化活性內(nèi)源性酶可溶部分的20倍；
[0013](3)制備未純化目標(biāo)酶的樣品:目標(biāo)酶誘導(dǎo)表達(dá)后收集宿主細(xì)胞用超聲處理、化學(xué)裂解或凍融裂解，將裂解液離心得上清液，再用0.22μπι濾膜過濾后的濾液為樣品；
[0014](4)建立免疫比濁法選擇性測定樣品中目標(biāo)酶蛋白量:以免疫原或其它某個(gè)目標(biāo)酶為參考品；在總體積為0.050到3.0ml的中性的磷酸鹽或Tris-HCl緩沖液中，將多抗與參考品混勻且參考品在反應(yīng)體系最終濃度在1.0?30.0mg/L，并在混合后的反應(yīng)體系加入分子量2，000到1,0000道爾頓的聚乙二醇達(dá)到30g/L以上；室溫反應(yīng)5.0到30min后測定310到410nm間某個(gè)波長的消光值及630到800nm間某個(gè)波長下的消光值，以前者消光值減去后者消光值為響應(yīng)信號(hào)即縱坐標(biāo)，以反應(yīng)體系所含參考品最終濃度為橫坐標(biāo)作圖得參考品的響應(yīng)曲線；用參考品終濃度的一次或二次多項(xiàng)式擬合響應(yīng)曲線，對(duì)應(yīng)最好擬合函數(shù)為響應(yīng)函數(shù)；以響應(yīng)信號(hào)達(dá)到擬合響應(yīng)曲線所得回歸估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差三倍對(duì)應(yīng)參考品最終濃度或響應(yīng)信號(hào)為檢測下限，與用響應(yīng)函數(shù)預(yù)測的響應(yīng)信號(hào)相差不超過回歸估計(jì)標(biāo)準(zhǔn)差兩倍的最大響應(yīng)信號(hào)或其對(duì)應(yīng)參考品最終濃度為定量上限；
[0015](5)測定樣品中目標(biāo)酶活性:用目標(biāo)酶的底物，常規(guī)測定未純化目標(biāo)酶樣品中目標(biāo)酶活性;用相同的活性單位定義，換算成樣品中目標(biāo)酶活性濃度；
[0016](6)測定樣品中目標(biāo)酶蛋白量:用樣品代替參考品與前述多抗反應(yīng)，以免疫比濁法選擇性測定樣品中目標(biāo)酶蛋白量;調(diào)整加樣量，使所得響應(yīng)信號(hào)比檢測下限高30%以上而低于定量上限對(duì)應(yīng)的響應(yīng)信號(hào)；用響應(yīng)函數(shù)換算成樣品中的目標(biāo)酶蛋白濃度；
[0017](7)計(jì)算樣品中目標(biāo)酶比活性:據(jù)前述所測樣品中目標(biāo)酶活性濃度除以免疫比濁法選擇性測定所得樣品中的目標(biāo)酶蛋白濃度，得到樣品中的目標(biāo)酶比活性；
[0018](8)比較未純化目標(biāo)酶比活性:對(duì)目標(biāo)酶比活性排序比較，或以起始酶或某個(gè)突變體為比較對(duì)象，將其余目標(biāo)酶比活性除以比較對(duì)象的比活性得到相對(duì)比活性，再進(jìn)行比較。
[0019]2、據(jù)權(quán)利要求1所述一種均相定量比較未純化酶及其突變體比活性的方法，其適合高通量快速比較目標(biāo)酶所構(gòu)成庫中各成分的比活性識(shí)別陽性突變體;其應(yīng)用過程還有如下特征:
[0020](— )此方法應(yīng)用不依賴于但也不排除用融合標(biāo)簽對(duì)目標(biāo)酶進(jìn)行重組表達(dá)；
[0021](二)所選裂解宿主細(xì)胞的操作過程，對(duì)目標(biāo)酶活性影響小于10%;
[0022](三)來自原核或真菌的目標(biāo)酶，首選在原核宿主細(xì)胞中重組表達(dá)；
[0023](四)來自高等真核細(xì)胞的目標(biāo)酶，分子量小于30，000道爾頓時(shí)直接在原核宿主細(xì)胞中表達(dá)，如分子量更大則用增溶標(biāo)簽在原核宿主中融合重組表達(dá)，或用昆蟲細(xì)胞重組表達(dá)；
[0024](五)制備針對(duì)目標(biāo)酶的多抗時(shí)，能對(duì)免疫原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的動(dòng)物含駱駝、豬都可用;凍存后的多抗，臨用前用中性磷酸鹽緩沖液或TriS-HCl緩沖液復(fù)溶，離心去沉淀，再用
0.22μπι濾膜過濾所得濾液就得到適合使用的多抗試劑；
[0025](六)免疫比濁測定目標(biāo)酶蛋白含量時(shí)緩沖液pH在6.0到8.0之間;適用的緩沖液包括但不限于磷酸鹽、三羥甲基氨基甲烷_HC1、HEPES和硼酸-硼砂、甘氨酸-氫氧化鈉。
[0026]應(yīng)用實(shí)施例
[0027]所用材料、試劑和設(shè)備
[0028]綠膿桿菌芳香硫酸酯酶(PAAS)載體pET28A、表達(dá)等見文獻(xiàn)[Liu H，etal.Analytical Sciences，2015;31(5):421-427]。測定活性緩沖液為 I.0Μ Tris-HCl pH9.0，含底物4-硝基苯基磷酸酯2.0mM;用405nm吸收監(jiān)測PAAS反應(yīng)，計(jì)算啟動(dòng)反應(yīng)8.0min到15min之間的吸收變化初速度換算成活性;每分鐘釋放1.0微摩爾的對(duì)硝基酚酶活性為一個(gè)單位(U) JAAS用Ni2+-NTA-瓊脂糖純化兩遍后比活高于34kU/g，按已報(bào)道最大比活性算純度>80%。
[0029]用MAPADA UV 1600PC分光光度計(jì)、B1tek ELX 800酶標(biāo)儀和Eon酶標(biāo)儀測定吸收。定點(diǎn)突變獲得PAAS突變體M72D和G138S;與野生型PAAS用相同表達(dá)載體。三種目標(biāo)酶誘導(dǎo)表達(dá)后用Ni2+-NTA-瓊脂糖純化一次，PAAS、G138S和M72D對(duì)應(yīng)最大比活性分別為18、5.6和
3.2kU/g;重復(fù)誘導(dǎo)表達(dá)純化三批，三種目標(biāo)酶比活性變異系數(shù)小于15 %。
[0030]應(yīng)用實(shí)施例1:兔抗PAAS多抗的制備
[0031]1.在無菌條件下，取0.40mg純化PAAS加弗氏完全免疫佐劑，用20mM pH7.4的磷酸鈉緩沖液稀釋到0.80ml;用5.0ml容量的塑料注射器將上述混合物反復(fù)多次混勻進(jìn)行乳化，直到注射器中的混合物象白色的泡沫狀混合物而在豎直狀態(tài)下粘壁而不流動(dòng);在無菌條件下，將注射器內(nèi)乳化后的免疫原，在新西蘭大白兔背部的皮下多點(diǎn)注射，盡量全部注射;免疫原在乳化完全后，在30分鐘內(nèi)注射;首次注射免疫原的時(shí)間稱為免疫過程的第一天；
[0032]2.到第15天，在無菌條件下，取0.20mg純化PAAS加弗氏不完全免疫佐劑，參照前述操作用磷酸鈉緩沖液稀釋后在注射器內(nèi)乳化;皮下多點(diǎn)注射免疫原;此為第二次免疫；
[0033]3.到第25天，參照第二次免疫，取0.20mg純化PAAS加弗氏不完全免疫佐劑，乳化后皮下多點(diǎn)注射;此過程共重復(fù)進(jìn)行三次，即累計(jì)免疫5次；
[0034]4.到第45天，用0.35 %戊巴比妥鈉耳緣靜脈注射麻醉大白兔;頸動(dòng)脈插管取不抗凝的全血于無菌燒瓶;將全血在37°C放置2小時(shí)，4°C放置過夜；無菌離心管4000rpm離心5min收集上清，再度無菌離心管I OOOOrpm離心15min收集上清為抗血清(避免收集表層漂浮狀成分)；50°C處理30min，0.22μπι濾膜過濾，分裝成0.1Oml，凍干;-20°C?_80°C下保存。
[0035]應(yīng)用實(shí)施例2:PAAS及其突變體的誘導(dǎo)表達(dá)及未純化目標(biāo)酶樣品制備
[0036]1.取轉(zhuǎn)化了PAAS及其突變體三種的表達(dá)載體，分別轉(zhuǎn)化大腸桿菌細(xì)胞BL21(DE3)，涂布在含卡那霉素的平板上挑選單克?。辉?8孔板上每孔加入含卡那霉素的TB培養(yǎng)基
0.50ml，將每個(gè)目標(biāo)酶的每個(gè)單克隆盡可能全部轉(zhuǎn)移到對(duì)應(yīng)的微孔中；37°C用180rpm培養(yǎng)放大12小時(shí);加IPTG到1.0mM，在16°C用11Orpm誘導(dǎo)表達(dá)20小時(shí)；
[0037]2.用1.50ml Ependorf離心管，加入微孔板上對(duì)應(yīng)的菌液0.40ml ;8000rpm離心10分鐘收集細(xì)胞；用20mM Tris-HCl pH 8.0的緩沖液洗滌細(xì)胞一次并用此緩沖液重懸到0.50ml;用SONICS Uibra Cell(Sonics&MateriaIs, INC.,53Church Hill