光免疫層析試紙板縱向切成4mm寬的熒光免疫層析試紙條，將其放入卡殼內(nèi)經(jīng)壓殼機(jī)處理得到免疫層析檢測(cè)卡。
[0064]第三步:樣品稀釋液的配制
[0065]取0.02M pH7.0的PBS緩沖液IL，加入8ml吐溫20，5.1g牛血清白蛋白和0.19g疊氮鈉，超聲直至固體全部溶解混合均勻。
[0066]第四步:樣本檢測(cè)
[0067]I)線性、檢測(cè)限和精密度評(píng)估:
[0068]采用陰性牛血清作為稀釋液，將抗苗勒管激素標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為5000、4500、4000、3500、3000、2500、2000、1500、1000、500 和 Opg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，取標(biāo)準(zhǔn)品 100μ1 加入100μ1樣品稀釋液，吹打15次后取100μ1加入到加樣孔8中，15分鐘后采用熒光檢測(cè)器檢測(cè)。結(jié)果表明，線性的相關(guān)系數(shù)r~2大于0.99，檢測(cè)限為30pg/ml，各濃度的檢測(cè)變異系數(shù)均小于8% 0
[0069]2)線性參數(shù)的驗(yàn)證:
[0070]采用低值人血清和高值人血清，配制濃度為5000、4000、3000、2000和1000pg/ml的抗苗勒管激素人血清溶液，每個(gè)樣本重復(fù)4次，結(jié)果表明，r~2大于0.99，最高檢測(cè)范圍可達(dá)到5000pg/mlο
[0071]3)準(zhǔn)確度的評(píng)估:
[0072]采用抗苗勒管激素濃度為60pg/ml的人血清樣本作為基礎(chǔ)樣本，加入同體積不同濃度的抗苗勒管激素標(biāo)準(zhǔn)物人血清，配制成濃度為4000、1000、600和300pg/ml的抗苗勒管激素人血清溶液。另一份樣本加入相同體積的陰性人血清，對(duì)回收樣本和基礎(chǔ)樣本進(jìn)行4次重復(fù)檢測(cè)分析，并進(jìn)行計(jì)算。結(jié)果表明，回收率在95%?105%范圍內(nèi)。
[0073]以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，并不用于限制本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明技術(shù)原理的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和變型，這些改進(jìn)和變型也應(yīng)視為本發(fā)明的保護(hù)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.一種抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于，包括以下步驟: 步驟I)探針固定墊制備:將抗苗勒管激素單克隆抗體按比例與活化白蛋白熒光膠乳微粒偶聯(lián)反應(yīng)制得抗苗勒管激素單克隆抗體熒光膠乳微粒，再將所述抗苗勒管激素單克隆抗體熒光膠乳微粒與羊抗兔IgG熒光膠乳微粒按一定比例混合得到混合熒光膠乳微粒，所述混合熒光膠乳微粒用熒光探針微球稀釋液稀釋后噴在玻璃纖維上制得探針固定墊； 步驟2)免疫層析試紙條制備:將樣品墊、探針固定墊、層析膜、吸水紙依次貼在PVC襯板上，將所述抗苗勒管激素單克隆抗體包被在層析膜的檢測(cè)線上，將羊抗兔IgG包被在層析膜控制線上，進(jìn)而制得免疫層析試紙條； 步驟3)樣品稀釋液制備:將包括有牛血清白蛋白、表面活性劑、分散劑和防腐劑的混合物與緩沖液混合均勻制得樣品稀釋液； 步驟4)樣品檢驗(yàn):取血清、血漿或全血樣品混合至所述樣品稀釋液，加入免疫層析試紙條進(jìn)行免疫層析反應(yīng)，層析反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)熒光檢測(cè)器熒光檢測(cè)。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:步驟I)中，所述活化白蛋白熒光膠乳微粒的制備是先將熒光膠乳微粒與活化劑反應(yīng)制得活化熒光膠乳微粒，再與白蛋白按比例偶聯(lián)反應(yīng)得白蛋白熒光膠乳微粒，所述白蛋白與活化熒光膠乳微粒的比例為0.05:100?0.2:100，所述白蛋白熒光膠乳微粒進(jìn)一步與活化劑反應(yīng)制得所述活化白蛋白熒光膠乳微粒，其中，所述白蛋白的種屬包括人、牛、羊或鼠。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:步驟I)中，所述羊抗兔IgG熒光膠乳微粒的制備是將羊抗兔IgG按比例與活化熒光膠乳微粒偶聯(lián)反應(yīng)制得，所述羊抗兔IgG與活化熒光膠乳微粒的混合比例為0.05:100?0.2:100。4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:步驟I)中，所述活化劑包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽和N-羥基硫代琥珀酰亞胺，二者重量比為1:6?1:1，所述1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽與熒光膠乳微粒的重量比為I: 100?5:100。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:步驟I)中，所述抗苗勒管激素單克隆抗體與活化白蛋白熒光膠乳微粒的混合比例為0.05:100?0.2:100，所述羊抗兔IgG與活化熒光膠乳微粒的混合比例為0.05:100?0.2:100，所述抗苗勒管激素單克隆抗體焚光膠乳微粒和羊抗兔IgG焚光膠乳微粒相混合的比例2:1?6:1。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:步驟I)中，將混合熒光膠乳微粒用熒光探針微球稀釋液稀釋2?6倍，以2?6ul/cm的速度均勻噴在寬度為0.7?1.3cm的玻璃纖維上，在30?55°C下干燥2?24h后制得探針固定墊。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:所述熒光探針微球稀釋液為含有蔗糖、牛血清白蛋白和表面活性劑的緩沖液，所述緩沖液包括PBS緩沖液、Tr i s緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液中的一種或幾種，所述表面活性劑為吐溫20或吐溫80。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)方法，其特征在于:步驟3)中，所述緩沖液包括PBS緩沖液、Tr i s緩沖液、甘氨酸緩沖液、MES緩沖液、HEPES緩沖液中的一種或幾種，所述表面活性劑為吐溫20、吐溫80、曲拉通X-100或聚乙二醇，所述防腐劑為疊氮鈉或proclin，所述分散劑為聚乙烯吡咯烷酮10K、聚乙烯吡咯烷酮40K或聚乙烯醇。9.一種抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)試劑盒，包括試劑盒體以及稀釋液瓶，所述試劑盒體包括免疫層析檢測(cè)卡，所述免疫層析檢測(cè)卡包括PVC襯板以及固定在PVC襯板上的樣品墊、探針固定墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，其特征在于: 所述樣品墊搭接在探針固定墊上，所述探針固定墊和吸水紙分別搭接在所述硝酸纖維素膜兩側(cè)，所述硝酸纖維素膜上設(shè)置有檢測(cè)線和控制線，所述檢測(cè)線內(nèi)包被有抗苗勒管激素單克隆抗體，所述控制線內(nèi)包被有羊抗兔IgG ； 所述探針固定墊由抗苗勒管激素單克隆抗體熒光膠乳微粒和羊抗兔IgG熒光膠乳微粒組成的混合熒光膠乳微粒干燥制得。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)試劑盒，其特征在于:所述免疫層析檢測(cè)卡還包括殼體，所述殼體上設(shè)置有加樣孔、檢測(cè)窗口、編碼區(qū)域和把手，所述加樣孔位于所述樣品墊處，所述檢測(cè)窗口位于所述檢測(cè)線和控制線處，所述編碼區(qū)域位于檢測(cè)窗口和把手之間，所述把手位于所述殼體上位于靠近吸水紙的一側(cè)。
【專利摘要】本發(fā)明涉及抗苗勒管激素的熒光免疫層析檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒。該方法步驟為探針固定墊制備、免疫層析試紙條制備、樣品稀釋液制備和樣品檢驗(yàn)，其中，將抗苗勒管激素單克隆抗體熒光膠乳微粒與羊抗兔IgG熒光膠乳微?；旌虾蠼?jīng)金稀釋液稀釋噴在玻璃纖維上制得探針固定墊，并將抗苗勒管激素單克隆抗體包被在檢測(cè)線上，將羊抗兔IgG包被在控制線上進(jìn)而制得免疫層析試紙條。本發(fā)明檢測(cè)試劑盒包括免疫層析檢測(cè)卡，其包括PVC襯板、樣品墊、探針固定墊、硝酸纖維素膜和吸水紙，該探針固定墊由抗苗勒管激素單克隆抗體熒光膠乳微粒和羊抗兔IgG熒光膠乳微?；旌细稍镏频谩Ｒ虼?，本發(fā)明具有檢測(cè)靈敏度高、準(zhǔn)確度高、操作簡(jiǎn)單、成本低的優(yōu)點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/577, G01N33/543, G01N33/558, G01N33/74
【公開號(hào)】CN105527448
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201511024292
【發(fā)明人】廖平璋, 張鵬, 張金林, 張華
【申請(qǐng)人】蘇州市博納泰科生物技術(shù)有限公司
【公開日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2015年12月31日