數(shù)字流體樣品分離設(shè)備和用于一步定量樣品分析的方法
【專利說明】數(shù)字流體樣品分離設(shè)備和用于一步定量樣品分析的方法
[0001]相關(guān)專利申請的交叉引用
[0002]本專利申請要求提交于2013年8月9日的美國臨時專利申請序列號61/864,346的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，該臨時專利申請全文以引用方式并入本文。
[0003]關(guān)于聯(lián)邦資助研究或開發(fā)的聲明
[0004]不適用
[0005]計算機(jī)程序附錄以引用方式并入
[0006]不適用
【背景技術(shù)】
[0007]1、
技術(shù)領(lǐng)域
[0008]本發(fā)明整體涉及一步法樣品制備和分析，更具體地講涉及懸浮液分離、多重區(qū)室化以及分離溶液中組分的數(shù)字?jǐn)U增和/或檢測的整合，其中可使用脫氣驅(qū)動流使該系統(tǒng)自動化。
[0009]2、背景探討
[0010]實時PCR目前是用于定量檢測體液樣品中的核酸(NA)的標(biāo)準(zhǔn)方法。生物體(通常是血液)中的病毒載量或病毒數(shù)量是指示抗病毒療法的有效性和疾病累進(jìn)的最重要標(biāo)記之一。美國食品藥品監(jiān)督管理局(US Food and Drug Administrat1n)批準(zhǔn)的常規(guī)HIV病毒載量監(jiān)測試驗使用實時聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(實時PCR)測定法。該方法通常涉及昂貴的設(shè)備(例如實時熱循環(huán)儀)，2-3小時的測定時間，需要受過訓(xùn)練的技術(shù)人員的多個人工步驟并且需要制備樣品以移除污染物。例如，在標(biāo)準(zhǔn)實時PCR測定中，樣品(例如血液)需要純化，因為由于血紅蛋白和IgG的螯合性質(zhì)會破壞Fe3+濃度，它們可抑制聚合酶活性。
[0011]由于血液細(xì)胞的不透明性會阻礙光學(xué)檢測路徑，從而可妨礙診斷測定，因此血漿分離是血液類蛋白和其他樣品組分診斷的共同步驟。從裂解的紅細(xì)胞釋放的血紅蛋白可通過螯合離子抑制其他酶反應(yīng)，因此在進(jìn)行幾乎所有測定之前希望移除血細(xì)胞。
[0012]樣品純化可通過酚/氯仿提取或硅膠離心柱進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)血漿分離技術(shù)通過離心進(jìn)行，這需要電源和龐大的設(shè)備。膜過濾和機(jī)械過濾方法也是流行的，然而，它們通常會阻塞或?qū)е氯苎饔?。其他利用水動抬升力、Zweifach-Fung效應(yīng)或慣性力的方法需要外部栗來精確控制流量。使用外部場例如聲學(xué)、電滲流和磁力的主動分離已得到利用。然而，這些分離還需要外部電源，具有高度復(fù)雜的芯片設(shè)計，并且需要外部設(shè)備。
[0013]還存在沉淀方法，例如錯流過濾、濾塞中的沉淀以及重力引起的分層。由于對紅細(xì)胞的低剪切應(yīng)力，這些沉淀系統(tǒng)的主要優(yōu)點是顯著減少溶血作用。然而，在所有討論的純化或分離方法中，尚待實現(xiàn)這些技術(shù)與樣品區(qū)室化的結(jié)合，以實現(xiàn)快速的一步法數(shù)字流體樣品分析。
[0014]可使用其他NA測定法，例如轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增或分支DNA測試，但受到與實時PCR相同的限制，即需要多個樣品制備步驟，大約3-6小時的測定時間和受過高強(qiáng)度訓(xùn)練的技術(shù)人員。此外，這些技術(shù)均需要中心實驗室的測試，因此必須傳送樣品，這可導(dǎo)致樣品降解。中心化還限制了遙遠(yuǎn)的、資源匱乏的地點的使用機(jī)會。
[0015]還開發(fā)了較新的基于ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測定)的技術(shù)。雖然它們可降低測試成本(大約5-23美元)并且是更簡單的、可執(zhí)行的測定法，但仍然是耗時的，需要大量的人工處理時間(6-72小時)。最新的側(cè)流試紙條已證實可檢測NA。然而，仍然需要多個人工步驟，并且這些測定法通常提供定性而非定量NA檢測。
[0016]希望將快速樣品制備和定量測定終點結(jié)果輸出結(jié)合到同一診斷芯片中，以簡化、降低成本并縮短流體樣品分析所需的步驟。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0017]本發(fā)明展示了提供低成本、便攜式技術(shù)的設(shè)備和方法，該技術(shù)將樣品流體分離(純化)和數(shù)字定量樣品分析結(jié)果輸出結(jié)合到一個流體設(shè)計中。根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的一個方面，可處理全血樣品，以在大約30分鐘內(nèi)進(jìn)行NA定量(如HIV病毒載量)。
[0018]在一個步驟中，數(shù)字分離(DS)芯片可自動分離樣品懸浮液，將樣品溶液分配到超過200個孔中并且使樣品區(qū)室化，以使數(shù)字等溫NA擴(kuò)增(如重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA))在10分鐘內(nèi)自動進(jìn)行，而無需外部電源。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到，DS芯片也可用于除等溫NA擴(kuò)增之外的測定法，例如定量蛋白質(zhì)分析、免疫測定法等。
[0019]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的一個方面，脫氣驅(qū)動流可用于將流體樣品移動和分配通過DS芯片，因此不需要外部電源或栗。該系統(tǒng)可以是完全便攜式的。另外，該系統(tǒng)可在不存在用于NA、蛋白質(zhì)、抗體等數(shù)字檢測的區(qū)室化的油相的情況下工作。跟隨后退彎液面的空氣塞可使孔自動區(qū)室化。
[0020]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的另一個方面，將樣品制備(懸浮液分離)和數(shù)字樣品分析結(jié)果輸出(樣品區(qū)室化)整合為具有數(shù)字分離設(shè)計的一個步驟。
[0021]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的另一個方面，DS芯片中的峭壁結(jié)構(gòu)可使體積大小在樣品區(qū)室化期間保持一致，并且可確保NA擴(kuò)增最小、來自顆粒(如紅細(xì)胞)的熒光干擾最小等。例如，據(jù)顯示，>95%的血細(xì)胞可通過峭壁結(jié)構(gòu)移除。
[0022]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的另一個方面，數(shù)字分離無溶血作用或阻塞。這是基于膜過濾的方法的常見問題。這是重要的，因為例如來自裂解紅細(xì)胞的血紅蛋白可顯著阻礙NA測定。
[0023]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的又一個方面，可在約1分鐘內(nèi)分離極大量的孔(10-1500個孔，30-100nl/孔)。50和ΙΟΟμΙ之間的流體樣品可在10分鐘內(nèi)處理完，得到每孔20-50μ?的數(shù)字化樣品?？赏ㄟ^按比例縮放孔的數(shù)量或大小來輕松地調(diào)整分離樣品的體積。此外，這可以是高通量系統(tǒng)。由于僅采集終點讀數(shù)，很多裝置與實時PCR相反可以平行運行，而實時PCR則順次運行樣品，因為需要實時數(shù)據(jù)點。
[0024]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的又一個方面，總測定時間可少于40分鐘，只需要最少的人工操作(加載樣品、等溫?zé)釡赜徒K點讀數(shù))。
[0025]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的又一個方面，DS芯片可作為等溫NA擴(kuò)增的平臺，動態(tài)范圍為13-1O6個拷貝/ml。僅通過改變孔大小來控制數(shù)字化即可定制動態(tài)范圍。該平臺技術(shù)可采用其他類型的NA測定法(等溫、PCR等)，從而提供獨特的無源慣性分離和數(shù)字NA測定的組合。
[0026]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的又一個方面，DS芯片的使用成本可以較低，因為分析樣品僅需要非常簡單的光學(xué)器件。終點數(shù)字結(jié)果輸出可通過標(biāo)準(zhǔn)熒光顯微鏡或具有濾光器的智能手機(jī)進(jìn)行。無需實時成像系統(tǒng)。
[0027]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的又一個方面，輔助脫氣室可整合進(jìn)DS芯片，以提高樣品加載速率至少于10分鐘。DS芯片的另一個實施例可整合拇指栗mi CroSIP技術(shù)，在這種技術(shù)中，脫氣驅(qū)動流可能是不可行的。
[0028]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的又一個方面，當(dāng)DS芯片儲存于真空食品包裝中時，可具有至少一年的壽命。在真空條件下儲存穩(wěn)定了凍干試劑，并避免其氧化，并且脫氣驅(qū)動加載仍保持完整功能。
[0029]根據(jù)本發(fā)明所公開的技術(shù)的另一個方面，DS芯片可設(shè)計為無出口的一次性芯片，因此可將生物危害性污染風(fēng)險減至最小。
[0030]該技術(shù)的另外方面將在本說明書的以下部分闡明，其中詳細(xì)說明的目的是完全公開該技術(shù)的優(yōu)選實施例，而非對其進(jìn)行限制。
【附圖說明】
[0031]參考以下附圖將更全面地理解本文所述的技術(shù)，這些附圖僅僅是為了進(jìn)行示意性的說明:
[0032]圖1A是數(shù)字分離(DS)芯片的兩層設(shè)計實施例的示意圖。
[0033]圖1B是根據(jù)本公開實施例的峭壁結(jié)構(gòu)的放大視圖。
[0034]圖2A、圖2B和圖2C是流經(jīng)DS芯片的樣品流體的透視圖的示意圖。
[0035]圖3A、圖3B和圖3C是圖2A、圖2B和圖2C中示出的示意圖的頂視圖。
[0036]圖4是根據(jù)本公開實施例的具有拇指栗的DS芯片的示意圖。
[0037]圖5A至圖5F是根據(jù)本公開實施例的DS芯片中數(shù)字血漿分離的延時圖像。
[0038]圖6A至圖6D是流經(jīng)通道并跨過峭壁結(jié)構(gòu)的血液樣品的延時圖像。
[0039I圖6E是流過峭壁結(jié)構(gòu)的血液的示意圖。
[0040]圖7是坐標(biāo)圖，其示出了血漿分離在兩分鐘內(nèi)開始，并且通過改變峭壁結(jié)構(gòu)和孔的脫氣表面積可調(diào)整分離的血漿體積和速度。
[0041]圖8是示出血漿分離效率的坐標(biāo)圖。
[0042]圖9A和圖9B分別示出了有和無峭壁結(jié)構(gòu)的血液樣品區(qū)室化圖像。
[0043]圖10是采用芯片上RPA進(jìn)行不同模板濃度的數(shù)字?jǐn)U增的結(jié)果的坐標(biāo)圖。
[0044]圖1IA和圖1IB是坐標(biāo)圖，其示出了RPA反應(yīng)需要血漿分離和稀釋的方式。
[0045]圖12是根據(jù)本公開的一個實施例的設(shè)置在加熱包上的DS芯片的示意圖。
[0046]圖13是示意圖，其示出了在乙酸鈉加熱包上加熱DS芯片期間進(jìn)行溫度測定。
[0047]圖14是坐標(biāo)圖，其示出了在DS芯片加熱期間隨時間推移的溫度測定值。
[0048]圖15是全血檢測測定中一步法30分鐘HIVNA測定的隨時間推移的熒光坐標(biāo)圖。
[0049]圖16A是O分鐘時DS芯片上的熒光圖像，圖16B