一種利用細胞血素c自組裝過氧化物酶測定表面活性劑臨界膠束濃度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于表面活性劑臨界膠束濃度測定技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用細胞血素 C自組裝過氧化物酶測定表面活性劑臨界膠束濃度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 表面活性劑是由極性頭部和非極性尾部組成的雙親極性分子，它既可以與極性官 能團，又可以與非極性官能團相互作用。在極性溶劑中，當表面活性劑濃度逐漸增大到一定 濃度時，許多表面活性劑分子會自發(fā)聚焦成膠束，通常將表面活性劑形成膠束所需的最低 濃度定義為該表面活性劑的臨界膠束濃度(CMC)。
[0003] 臨界膠束濃度CMC可以表征表面活性劑的表面活性，也是溶液性質(zhì)發(fā)生變化的臨 界點，其理化性質(zhì)在形成膠束前后發(fā)生顯著變化。因此CMC值對表面活性劑的研究極其重 要，是其具有重要參考價值的數(shù)據(jù)。
[0004] 現(xiàn)有的研究報道中大多是借助理化性質(zhì)的變化來表征表面活性劑的CMC，如:表面 張力法、電導(dǎo)法、染料法、光散射法、增容作用法等。使用不同的理化性質(zhì)方法對表面活性劑 CMC測定時，由于靈敏度以及所測量的表面活性的響應(yīng)范圍不同等因素的影響，往往造成測 定的CMC值有較大差異。此外，現(xiàn)有的測定方法常需要使用操作較為復(fù)雜、價格昂貴的儀器， 不利于推廣。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)缺陷，提供一種利用細胞血素 C自組裝過氧化物酶 測定表面活性劑臨界膠束濃度的方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案： 一種利用細胞血素 C自組裝過氧化物酶測定表面活性劑臨界膠束濃度的方法，其包括 如下步驟： 1)取不同質(zhì)量的表面活性劑分別溶于磷酸鹽緩沖液中，獲得一系列具有一定濃度梯度 的表面活性劑溶液； 2 )向步驟1)所得各溶液中加入細胞色素 C; 3) 向步驟2)所得各溶液中加入愈創(chuàng)木酚； 4) 向步驟3)所得各溶液中加入雙氧水，于25 - 50°C開始酶促反應(yīng)，同時記錄愈創(chuàng)木酚 氧化初始速度； 5) 以表面活性劑濃度為橫坐標，以愈創(chuàng)木酚氧化初始速度為縱坐標，在excel中進行作 圖，添加移動平均趨勢線冪趨勢線和移動平均趨勢線，通過改變移動平均趨勢線中的移動 平均周期使移動平均趨勢線與冪趨勢線相切，切點對應(yīng)的表面活性劑濃度即為臨界膠束濃 度。
[0007] 具體的，酶促反應(yīng)中（即以添加雙氧水后所獲得的體系為基準，來計量體系中表面 活性劑、細胞色素 C、愈創(chuàng)木酚以及H2〇2的濃度），細胞色素 C的濃度為2 -16 ymol/L;愈創(chuàng)木 酸的初始濃度為1.5 mmol/L;雙氧水以H2O2計，H2O2的初始濃度為0.5 mmol/L。
[0008] 優(yōu)選的，步驟4)中所述表面活性劑可以為十二烷基磺酸鈉（SDS)、十烷基硫酸鈉 (SDeS)、十二烷基肌氨酸鈉（SLS)、十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)、十二烷基三甲基氯化銨 (DTAC)或十二烷基三甲基溴化銨(DTAB)等。
[0009] 當加入h2〇2后，酶促反應(yīng)開始進行，愈創(chuàng)木酚氧化初始速度可通過測量四鄰甲氧基 連HKTetraguaiacol，470nm處摩爾吸光系數(shù)為26.6 mirVirf1)的形成速率來獲得（如下式 所示）： .:4::愈:創(chuàng)本齡:·:十:2 .?? ~一·、、、、+:懷部甲:氧塞連酸::...:十 4 ..Ha.Q. 〇
[0010] 具體的，步驟4)中所述愈創(chuàng)木酸氧化初始速度通過下述公式計算獲得：
式中，v為愈創(chuàng)木酚氧化初始速度； 八2、六1分別為七2、1：1時四鄰甲氧基連酸47〇111]1處的吸光值山、1：1單位5(^2、1：1取值均不大 于20秒）； b為比色皿光程，lcm; ε為四鄰甲氧基連酚470nm處的摩爾吸光系數(shù)。
[0011] 細胞色素 C是含有血紅素的一類蛋白質(zhì)，分子直徑為3 nm左右。細胞色素 C中心鐵 離子與卟啉環(huán)產(chǎn)生四個配位鍵，另外分別與甲硫氨酸(met-80)和組氨酸(his-18)產(chǎn)生配 位，使細胞色素 C具有電子傳遞作用。天然細胞色素 C過氧化物酶活性極低，但具有非常好的 穩(wěn)定性，可耐受寬范圍的pH環(huán)境(pH 2~11)及120 °C以上的高溫環(huán)境。表面活性劑如:十二 烷基磺酸鈉 (Sodium dodecyl sulfate, SDS)，具有極性頭部和非極性尾部結(jié)構(gòu)，當其濃度 達到臨界膠束濃度時在極性溶液中可自發(fā)形成膠團結(jié)構(gòu)。因此，本發(fā)明提出利用細胞血素 C 與表面活性劑自組裝形成膠團結(jié)前后過氧化物酶活性不同的原理（原理示意圖如圖1所 示），通過測量細胞色素 C與不同濃度表面活性劑組裝時所具有的過氧化物酶活性，獲得成 膠團前后拐點，同時并采用一種新數(shù)據(jù)處理方法，獲得表面活性劑的CMC。
[0012] 和現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明方法的有益效果： 利用細胞血素 C與表面活性劑自組裝形成膠團結(jié)前后過氧化物酶活性不同的原理，通 過測量細胞色素 C與不同濃度表面活性劑組裝時所具有的過氧化物酶活性，經(jīng)數(shù)據(jù)處理，能 夠獲得表面活性劑的CMC。本發(fā)明方法適用于測量離子型表面活性劑的CMC，具有工作pH、溫 度范圍廣，操作簡便，靈敏度高，重復(fù)性好等優(yōu)點。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本發(fā)明測定方法的原理示意圖； 圖2為本發(fā)明測定方法中CMC的獲取過程示意圖； 圖3為細胞色素 C濃度對CMC測定的影響； 圖4為磷酸鹽緩沖液pH值對CMC測定的影響； 圖5為酶促反應(yīng)溫度對CMC測定的影響。
【具體實施方式】
[0014] 以下結(jié)合實施例對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步地詳細介紹，但本發(fā)明的保護范圍 并不局限于此。
[0015] 下述以十二烷基磺酸鈉(SDS)為表面活性劑，進行其CMC的測定。
[0016]原理及方法 1.1試劑： 磷酸鹽緩沖液(Na2HP〇4-NaH2P〇4)、天然細胞色素 C(Cyt c，MW=886.9，上海寶蔓生物制 品有限公司）、愈創(chuàng)木酚溶液(Guaiaco 1，Sigma公司）、過氧化氫(30% H2〇2)、雙蒸水(H20)。待 測表面活性劑(十二烷基磺酸鈉，SDS)。
[0017] 1.2試劑配制。
[0018] ①磷酸鹽緩沖液(Na2HP〇4_NaH2P〇4)的配制： 取89.5g Na2HP〇4和39.0g NaH2P〇4分別用雙蒸水定溶于500ml容量瓶，摩爾濃度為 500mmol/L。實驗所需緩沖液濃度為50mmol/L，分別將Na2HP〇4和NaH2P〇4母液稀釋10倍后，將 二者按不同體積比分別調(diào)制所需pH值。配制好后，4°C低溫儲存。
[0019] ②天然細胞色素 C(Cyt c)溶液的配制： 取0.62g粉末狀馬心細胞色素 C，50ml雙蒸水溶解，摩爾濃度為lmmol/L。配制好后，-20 °C冷凍儲存。
[0020] ③愈創(chuàng)木酚(Gua iaco 1)溶液的配制： 取0.5ml濃度為9mol/L的愈創(chuàng)木酚溶液，加入99ml溫熱(<60°C)雙蒸水中，搖晃，使愈創(chuàng) 木酚充分溶解于雙蒸水中，稀釋后的摩爾濃度為45mmol/L。配制好后，避光常溫儲存。
[0021] ④典型過氧化氫(h2〇2)溶液的配制： 取13.5μ1濃度為1 Omo VL的H2〇2溶液，加入27ml磷酸鹽