一種基于單個熒光分子漂白成像檢測分子/離子的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明主要涉及一種高靈敏檢測分子或離子的方法，具體涉及一種基于單個熒光 分子漂白成像檢測分子/離子的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 目前定量檢測分子主要依賴于氣相色譜法，液相色譜法及質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)等方法， 檢測離子主要使用原子吸收分光光度計(jì)、原子熒光分光光度計(jì)、ICP-MS等。但是這些方法具 有需要昂貴的儀器、專業(yè)的分析師、樣品前處理復(fù)雜、分析時(shí)間長等缺點(diǎn)，因此，亟需尋找克 服這些缺點(diǎn)的新型檢測方法。
[0003] 化學(xué)生物傳感器是一類以生物活性單元為識別元件，結(jié)合化學(xué)、物理轉(zhuǎn)換元件，對 被分析物具有高特異選擇性的裝置。其具有靈敏度高、檢測速度快、操作簡便、成本低等優(yōu) 點(diǎn)，已廣泛應(yīng)用于生物分子、化學(xué)離子等方面的檢測。其中，近年發(fā)展起來的核酸適體，是一 種有競爭力的識別元件，它是一種經(jīng)體外篩選技術(shù)SELEX(指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化)篩選出 的能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其他小分子物質(zhì)的寡聚核苷酸片段。通常，核酸適體是一條單鏈核 酸分子，其識別過程主要是基于其構(gòu)象的轉(zhuǎn)換，從而引起電化學(xué)、光學(xué)等信號的變化，進(jìn)而 實(shí)現(xiàn)目標(biāo)分子的檢測。如果將核酸適體序列合理的分開成兩個片段，形成"裂開型"核酸適 體，共同來識別一個目標(biāo)檢測物，將更有利于核酸適體的廣泛應(yīng)用?；?裂開型"核酸適體 開發(fā)的比色法、熒光法、電化學(xué)法等已成功地實(shí)現(xiàn)了多個生物分子的檢測。但是，這些方法 的傳感策略復(fù)雜，靈敏度還有待進(jìn)一步提高。
[0004] 單分子檢測技術(shù)的發(fā)展讓單個熒光分子的檢測變得更為便利。單個熒光分子成像 能記錄熒光分子的強(qiáng)度的變化。研究表明，單個熒光分子的漂白過程呈現(xiàn)出單步漂白的過 程，熒光斑點(diǎn)的漂白步數(shù)表示分子的數(shù)目，這為準(zhǔn)確定量熒光分子提供了理論上的可能?；?于熒光分子的單步漂白的單分子計(jì)算已經(jīng)被應(yīng)用于多個領(lǐng)域，其中包括計(jì)算單個顆粒上蛋 白質(zhì)/DNA交聯(lián)的數(shù)目；計(jì)算膜結(jié)合蛋白中亞單位的個數(shù);測量活細(xì)菌細(xì)胞中功能PspA復(fù)合 物以及非入侵性的醫(yī)學(xué)診斷。然而利用"裂開型"核酸適體的兩個片段形成簡單的"三明治 夾心型"結(jié)構(gòu)來識別生物分子/離子，運(yùn)用單個熒光分子計(jì)數(shù)方法來考量核酸適體識別的效 率，將能進(jìn)一步提尚檢測的靈敏度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種高靈敏，能快速進(jìn)行多種小分子、離子檢測的基于單 個熒光分子漂白成像檢測分子/離子的方法。
[0006]為達(dá)上述目的，本發(fā)明所采用的技術(shù)方案是:一種基于單個熒光分子漂白成像檢 測分子/離子的方法，該方法是根據(jù)"裂開型"核酸適體能特異性識別目標(biāo)檢測分子/離子， 將該"裂開型"核酸適體裂開成的兩條核酸序列分別進(jìn)行熒光染料標(biāo)記后作為識別熒光探 針以形成目標(biāo)分子識別系統(tǒng);利用單個熒光分子的單步漂白性質(zhì)，結(jié)合"裂開型"核酸適體 的共同識別目標(biāo)檢測分子/離子的特性，將目標(biāo)分子識別系統(tǒng)與待測樣品溶液進(jìn)行混合，使 待測樣品溶液中的目標(biāo)檢測分子/離子與該目標(biāo)分子識別系統(tǒng)特異性結(jié)合形成標(biāo)記熒光染 料團(tuán)聚體;再以顯微鏡為檢測成像平臺、以成像檢測器為記錄儀，分析熒光分子的漂白步數(shù) 即熒光分子的聚合度以考查熒光染料團(tuán)聚體的分子個數(shù)，進(jìn)而計(jì)算目標(biāo)檢測分子/離子的 濃度。
[0007] 具體地，本方法是根據(jù)"裂開型"核酸適體能特異性識別目標(biāo)檢測分子/離子，將目 標(biāo)檢測分子/離子對應(yīng)的"裂開型"核酸適體裂開成兩條核酸序列，一條核酸序列直接標(biāo)記 上一個熒光染料，記為Probel;另一條核酸序列，記為Probe2 ;然后準(zhǔn)備包含有多個重復(fù) Probe2核酸序列的識別探針，并且標(biāo)記上與前述核酸序列標(biāo)記相同的熒光染料，記為N-Probe2，其中N為Probe2重復(fù)序列的數(shù)量，N為3-100;將標(biāo)記有相同熒光染料的Probel與N-Probe2溶液組成目標(biāo)分子識別系統(tǒng)，該系統(tǒng)中識別熒光探針Probel與N-Pr 〇be2的濃度比為 N:l;再將待測樣品溶液與該目標(biāo)分子識別系統(tǒng)混合、靜置，使待測樣品溶液中的目標(biāo)檢測 分子/離子與該目標(biāo)分子識別系統(tǒng)特異性結(jié)合形成標(biāo)記熒光染料團(tuán)聚體(見圖1);再以顯微 鏡為檢測成像平臺、以成像檢測器為記錄儀，分析熒光分子的漂白步數(shù)即熒光分子的聚合 度以考查熒光染料團(tuán)聚體的分子個數(shù)，進(jìn)而計(jì)算目標(biāo)檢測分子/離子的濃度。
[0008] 更具體地，完成上述檢測方法的具體步驟為：
[0009] (1)根據(jù)目標(biāo)檢測分子/離子，選擇對應(yīng)的能特異性識別目標(biāo)檢測分子/離子的"裂 開型"核酸適體(此方法為現(xiàn)有技術(shù)）。將該核酸適體裂開成兩條核酸序列，一條核酸序列直 接標(biāo)記上一個熒光染料，記為Probel;另一條核酸序列，記為Pr 〇be2;然后準(zhǔn)備包含有多個 重復(fù)Probe2核酸序列的識別探針，并且標(biāo)記上與前述核酸序列標(biāo)記的熒光染料相同的熒光 染料，記為N-Probe2。
[0010] (2)用?田直為6-11的緩沖液(可為1^8-!1(：1緩沖液或硼酸緩沖液），將?仰&61與1 Probe2分別配制成不同濃度的溶液(溶液濃度為l(T6-l(T12m〇l/L)，并用鹽酸緩沖液配制一 系列濃度的待測樣品溶液(樣品溶液濃度為l(T 6-l(r12m〇l/L)。
[0011] (3)將配制好的Probel溶液與N-Pr〇be2溶液按濃度比為N: 1的比例混合，形成目標(biāo) 分子識別系統(tǒng)。
[0012] ⑷將配制的一系列濃度的待測樣品溶液，分別與目標(biāo)分子識別系統(tǒng)混合，靜置反 應(yīng)。目標(biāo)檢測分子/離子將與目標(biāo)分子識別系統(tǒng)特異性的結(jié)合，形成熒光染料團(tuán)聚體。整個 過程在室溫條件下進(jìn)行。根據(jù)識別熒光探針的濃度來添加目標(biāo)檢測分子/離子的濃度，合適 的濃度為l〇_ 6-l〇_12mol/L。待測樣品濃度過低，成像區(qū)域目標(biāo)物過少，不利于檢測的速度;待 測樣品濃度過高，則會增加區(qū)分單個染料團(tuán)聚體的難度，增加檢測的假陽性。
[0013] (5)取步驟(4)中混合溶液4yL滴加到載玻片上，蓋上蓋玻片，用指甲油涂抹蓋玻片 四周，送顯微鏡觀察。并記錄各熒光斑點(diǎn)（熒光分子)的漂白情況。
[0014] (6)應(yīng)用軟件分析各熒光斑點(diǎn)的漂白步數(shù)(如圖2)，即各熒光斑點(diǎn)的聚合度。
[0015] (7)根據(jù)公式Y(jié) = P1/(P1-X)，可計(jì)算不同目標(biāo)檢測分子/離子的濃度。其中，X為目 標(biāo)檢測分子/離子濃度，Υ為熒光分子的聚合度，Ρ1為熒光染料團(tuán)聚體中的最大熒光分子個 數(shù)，Ρ1>Χ 〇
[0016] 上述熒光染料的發(fā)光波長為300-850nm，即在該范圍內(nèi)的熒光染料都適用，如CY5、 CY3、Alexa 488、Alexa 594、T0T0-1等。
[0017] 上述提及的顯微鏡為落射熒光顯微鏡、全內(nèi)反熒光顯微鏡、掃描共聚焦熒光顯微 鏡或微分干涉相差顯微鏡等，其正置與倒置顯微鏡皆可。
[0018] 上述提及的成像檢測器為電子倍增耦合器件(EMCCD)、相機(jī)或光電倍增管等一切 可以用于成像的器件。成像檢測時(shí)用的成像光源為汞燈、氙燈、鹵素?zé)艋蚣す馄鞯取?br>[0019] 本方法以能特異性識別分子/離子的并且標(biāo)記有熒光染料的"裂開型"核酸適體為 響應(yīng)元件，構(gòu)建一個能特異性識別目標(biāo)檢測分子/離子引起標(biāo)記熒光染料團(tuán)聚的生物傳感 策略，根據(jù)熒光分子的漂白步數(shù)來考查熒光染料團(tuán)聚體的分子個數(shù)，進(jìn)而計(jì)算目標(biāo)檢測分 子/離子的濃度。如此，本方法在單分子水平上探測目標(biāo)分子的濃度，檢測下限可以達(dá)到fM; 只要能篩選出相應(yīng)"裂開型"核酸適體，就能實(shí)現(xiàn)多種的小分子、離子的檢測;本方法檢測迅 速，不需要專業(yè)的操作人員，容易推廣，適用各種檢驗(yàn)檢疫測部門。
【附圖說明】
[0020] 圖1為本發(fā)明方法檢測原理示意圖。
[0021] 圖2為以腺苷為檢測對象時(shí)的熒光團(tuán)聚體的單步及多步(二至八步)漂白示意圖。
[0022] 圖3為檢測腺苷的數(shù)據(jù)曲線示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]下面結(jié)合實(shí)施例，對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)描述。
[0024]以下實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，但不用以限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施 例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。
[0025] 實(shí)施例1
[0026]以腺苷為檢測對象，用能識別腺苷的"裂開型"核酸適體為識別探針，利用落射式 熒光顯微鏡成像，觀測熒光斑的漂白情況，記錄漂白步數(shù)，結(jié)合待測物濃度與熒光聚合度的 關(guān)系，實(shí)現(xiàn)腺苷的高靈敏檢測。
[0027] 具體步驟如下：
[0028] 1.用于檢測腺苷的識別熒光探針的設(shè)計(jì)與選擇，其核苷酸序列為：
[0029] Probel為：5'-CY5 -ACC TGG GGG AGT AT-3'（見SEQ ID No.l);
[0030] N-Probe2為：5，-CY5-TTT GCG GAG GAA GGT-TTT GCG GAG GAA GGT-TTT GCG GAG GAA GGT-TTT GCG GAG GAA GGT-TTT GCG GAG GAA GGT-TTT GCG GAG GAA GGT-TTT GCG GAG GAA GGT-TTT GCG GAG GAA GGT-3'（見SEQ ID No.2)。其中CY5為熒光染料。
[0031] 2.用硼酸緩沖液(