二氧化錳薄片模擬酶傳感器以及制備方法和t4pnk的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及模擬酶傳感器，具體地，涉及一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器以及制備方法和T4PNK的檢測方法。
【背景技術(shù)】
[0002]T4多核苷酸激酶(PNK)，一種5’激酶，自從它1965在大腸桿菌蛋白提取物感染偶數(shù)噬菌體第一次被發(fā)現(xiàn)，到目前為止，已成為最常用的分子生物學酶。它可以催化γ-三磷酸腺苷(ATP)的磷酸鹽殘留量5’末端的核苷酸或核苷酸的5。羥基軸承。這對細胞核酸代謝是非常重要的，特別是在細胞對DNA損傷的反應，這與許多人類疾病，如沃納綜合征，Bloom綜合征和1?01:111111111(1-1'1101118011-1'1101118011綜合征等都有著密切聯(lián)系。14?爾也被廣泛應用于檢測DNA加合物或寡核苷酸和DNA損傷修復。因此，一個敏感的，精確的用于檢測Τ4ΡΝΚ活性的和檢測其潛在抑制劑的實驗方法的發(fā)展是十分有必要的。
[0003]傳統(tǒng)的方法介紹了磷酸化檢測和DNA激酶活性測定，包括活潑的同位素32P標記，聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)，放射自顯影、熒光等方法。然而，這些方法都有著不同程度上的費時，費力，不敏感，或要求放射性標記底物的缺點。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器以及制備方法和T4PNK的檢測方法，該制備方法操作簡單，同時制得的傳感器對于T4PNK的檢測具有靈敏度高、檢測限低和操作簡單的特點。
[0005]為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器的制備方法，包括:
[0006]I)將MnO2納米片溶液與TMB(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)溶液混合以制得MnO2-TMB混合溶液；
[0007]2)將發(fā)夾DNA溶解于Tris-HCl緩沖溶液中，然后加入ATP(三磷酸腺苷)與λΕΧ0(λ外切酶)以混合制得DNA溶液；
[0008]3)將MnO2-TMB混合溶液與DNA溶液混合以制得二氧化錳薄片模擬酶傳感器。
[0009]本發(fā)明還提供了一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器，該二氧化錳薄片模擬酶傳感器通過上述的方法制備而成。
[0010]本發(fā)明也提供了一種Τ4ΡΝΚ的檢測方法，包括:
[0011 ] I)將不同已知濃度的Τ4ΡΝΚ溶液與上述的二氧化錳薄片模擬酶傳感器進行接觸反應；
[0012]2)待反應體系的顏色穩(wěn)定后，檢測反應體系的吸光度，然后以吸光度為縱坐標，Τ4ΡΝΚ的濃度為橫坐標繪制標準曲線或者獲得標準曲線方程；
[0013]3)將未知濃度的Τ4ΡΝΚ溶液與上述的二氧化錳薄片模擬酶傳感器進行接觸反應，接著檢測反應體系的吸光度，然后根據(jù)標準曲線或者標準曲線方程以得知未知濃度的T4PNK溶液的濃度。
[0014]通過上述技術(shù)方案，本發(fā)明提供的二氧化錳薄片模擬酶傳感器的反應機理如圖1所示:在二氧化錳薄片模擬酶傳感器中，二氧化錳納米片能夠起到模擬酶的功效，在模擬酶的存在下，TMB能夠被催化顯色為深藍色，而未經(jīng)過磷酰化反應的發(fā)夾DNA不能夠被λΕΧΟ切割為單鏈，仍然以雙鏈的形式存在；一旦二氧化錳薄片模擬酶傳感器中加入Τ4ΡΝΚ，由于Τ4ΡΝΚ能夠與發(fā)夾DNA的5 ’端磷?；磻?，進而使得DNA能夠給特異性的λΕΧΟ切割為單鏈，此時的單鏈DNA對于二氧化錳模擬酶的活性有抑制作用，進而使得TMB的顏色逐漸變淡;整個體系的顏色的深淺與Τ4ΡΝΚ的濃度的對數(shù)呈線性關(guān)系，進而使得本發(fā)明提供的二氧化錳薄片模擬酶傳感器對于Τ4ΡΝΚ的檢測具有優(yōu)異的靈敏度和檢測限。此外，本發(fā)明提供的比色模擬酶傳感器的制備過程中使用的是無標記的DNA，操作簡單，成本很低，避免任何化學標記和修飾，從而使得該傳感器便于大范圍的使用。
[0015]本發(fā)明的其他特征和優(yōu)點將在隨后的【具體實施方式】部分予以詳細說明。
【附圖說明】
[0016]附圖是用來提供對本發(fā)明的進一步理解，并且構(gòu)成說明書的一部分，與下面的【具體實施方式】一起用于解釋本發(fā)明，但并不構(gòu)成對本發(fā)明的限制。在附圖中:
[0017]圖1是本發(fā)明提供的二氧化錳薄片模擬酶傳感器的工作原理圖；
[0018]圖2是檢測例I中MnO2納米片的低倍SEM圖；
[0019]圖3是檢測例I中MnO2納米片的高倍SEM圖；
[0020]圖4是檢測例2中紫外吸收光譜圖；
[0021]圖5是檢測例3中紫外吸收光譜圖；
[0022]圖6是應用例I中紫外吸收光譜圖；
[0023]圖7是圖6中最高吸光強度結(jié)果統(tǒng)計圖；
[0024]圖8是應用例2中不同濃度的λΕΧΟ的紫外吸收光譜圖；
[0025]圖9是應用例2中不同濃度的ATP的紫外吸收光譜圖；
[0026]圖10是應用例3中不同培養(yǎng)時間的紫外吸收光譜圖。
【具體實施方式】
[0027]以下對本發(fā)明的【具體實施方式】進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的【具體實施方式】僅用于說明和解釋本發(fā)明，并不用于限制本發(fā)明。
[0028]本發(fā)明提供了一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器的制備方法，包括:
[0029]I)將MnO2納米片溶液與ΤΜΒ(3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺)溶液混合以制得MnO2-TMB混合溶液；
[0030]2)將發(fā)夾DNA溶解于Tris-HCl緩沖溶液中，然后加入ATP(三磷酸腺苷)與λΕΧ0(λ外切酶)以混合制得DNA溶液；
[0031]3)將MnO2-TMB混合溶液與DNA溶液混合以制得二氧化錳薄片模擬酶傳感器。
[0032]在上述的制備方法的步驟I)中，各物料的用量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優(yōu)異的靈敏度和檢測限，優(yōu)選地，在步驟I)中，MnO2納米片溶液中MnO2的濃度為3-15mmol/L，TMB溶液的濃度為30-50mmol/L;并且相對于ImL的MnO2納米片溶液，TMB溶液的用量為l_2mL。
[0033]在上述的制備方法的步驟I)中，混合條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優(yōu)異的靈敏度和檢測限，優(yōu)選地，在步驟I)中，混合至少滿足以下條件:混合溫度為15-30°C，混合時間為4-1 Omin。
[0034]在上述的制備方法的步驟2)中，各物料的用量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優(yōu)異的靈敏度和檢測限，優(yōu)選地，在步驟2)中，相對于10nmol的發(fā)夾DNA，ATP的用量為10-15ηπιο1，λΕΧ0的用量為10-15U，Tris-HCl緩沖溶液的用量為20-30yL;
[0035]在上述的制備方法的步驟I)中，Tris-HCl緩沖溶液以及DNA的種類可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優(yōu)異的靈敏度和檢測限，優(yōu)選地，Tris-HCI緩沖溶液的pH為7.1-7.5，發(fā)夾DNA的序列號為5 ’ -GGCCTTGGATTGAAGGGAGCTCTACGGCC-3’。
[0036]在上述的制備方法的步驟3)中，各物料的用量可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優(yōu)異的靈敏度和檢測限，優(yōu)選地，在步驟3)中，相對于I體積份的DNA溶液，MnO2-TMB混合溶液的用量為3-5體積份。
[0037]在上述的制備方法的步驟3)中，混合條件可以在寬的范圍內(nèi)選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優(yōu)異的靈敏度和檢測限，優(yōu)選地，在步驟3)中，混合至少滿足以下條件:混合溫度為15-30°C，混合時間為15-25min。
[0038]在本發(fā)明中,MnO2納米片溶液的制備方法可以是本領(lǐng)域中任何一種常規(guī)的制備方法，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優(yōu)異的靈敏度和檢測限，優(yōu)選地，在步驟I)之前，該制備方法還包括:將TMA(四甲基胺鹽)溶液、H2O2溶液與錳源進行接觸反應以制得Μηθ2納米片溶液。
[0039]在上述MnO2納米片溶液的制備方法中，各物料的用量可以在寬的范圍選擇，但是為了使得制得的二氧化錳薄片模擬酶傳感器具有更優(yōu)異的靈敏度和檢測限，優(yōu)選地，TMA溶液的濃度為1-1.5mmol/L，H202溶液的濃度為20-40重量％ ;并且，相對于Ig的錳源，TMA的用量為15-25mL，H2O2溶液的用量為2_4mL。
[0040]在上述MnO2納米片溶液的制備方法中，TMA以及錳源的具體種類可以在寬的范圍選擇，但是從成本上考慮，優(yōu)選地，TMA為四甲基氫氧化銨，錳源為四水合氯化錳硫酸錳、氧化猛和氫氧化猛中的一種或多種。
[0041]在上述MnO2納米片溶液的制備方法中，接觸反應的條件可以在寬的范圍選擇，但是為了提高納米二氧化錳的產(chǎn)率，優(yōu)選地，接觸反應至少滿足以下條件:反應溫度為15-25°C，反應時間為10-20s。
[0042]本發(fā)明還提供了一種二氧化錳薄片模擬酶傳感器，該二氧化錳薄片模擬酶傳感器通過上述的方法制備而成。
[0043 ]本發(fā)明也提供了一種T4PNK的檢測方法，包括:
[0044]I)將不同已知濃度的T4PNK溶液與上述的二氧化錳薄片模擬酶傳感器進行接觸反應；
[0045]2)待反應體系的顏色穩(wěn)定后，檢測反應體系的吸光度，然后以吸光度為縱坐標，T4PNK的濃度為橫坐標繪制標準曲線或者獲得標準曲線方程；
[0046]3)將未知濃度的T4PNK溶液與上述的二氧化錳薄片模擬酶傳感器進行接觸反應，接著檢測反應體系的吸光度，然后根據(jù)標準曲線或者標準曲線方程以得知未知濃度的T4PNK溶液的濃度。
[0047]在上述檢測方法中，為了便于T4PNK、發(fā)夾DNA以及λΕΧΟ之間能夠充分地反應，優(yōu)選地，在步驟I)中，接觸反應首先在30-40°C下反應25-35min，然后在70-80°C下反應5-15min。
[0048]以下將通過實施例對本發(fā)明進行詳細描述。以下實施例中，牌號A40的發(fā)夾DNA(序列號:5 ’-GGCCTTGGATTGAA GGGAGCTCTACGGCC-3 ’)、ATP和T4PNK( 10U/uL)為上海生工公司的市售品，AEX0(10U/uL)是賽默飛世爾公司的市售品，H202(30wt% ) ,MnCl2.4H20(99.99%)為國藥集團化學試劑有限公司(上海，中國)的市售品。
[0049]紫外吸收光譜是通過日本日立公司牌號為UV-3010的紫外-可見分光光度計的檢測而得，SEM檢測室通過日本日立公司牌號為S-4800的電子掃描顯微鏡的檢測而得。
[0050]制備例I
[0051 ] MnO2納米片溶液的制備:
[0052]利用“K.Kai ,Y.Yoshida ,H.Kageyama ,G.Saito ,T.1shigaki , Y.Furukawa andJ.Kawamata，J.Am.Chem.Soc.,2008,130,15938-15943.”報道的方法進行制備:在25°C的敞口條件下，將12mL的四甲基氫氧化銨溶液(1.0M，溶劑為水)、2mL的H2O2溶液(30wt %，溶劑為水)，加入至1mL氯化錳溶液中(含有0.593g的MnCl2.4H20)反應15s以制得MnO2納米片溶液。
[0053]實施例1
[0054]I)在25°C下，將ImL的上述MnO2納米片溶液(1mM)與ImL的TMB(40mM)溶液混合5m