基于氣單胞菌溶素生物納米通道檢測端粒長度的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生命科學(xué)領(lǐng)域的DNA單分子檢測技術(shù)，具體的是一種基于氣單胞菌溶素生物納米通道檢測端粒長度的方法。
【背景技術(shù)】
[0002]端粒是位于染色體末端的一小段DNA-蛋白質(zhì)復(fù)合體，具有穩(wěn)定染色體末端結(jié)構(gòu)和控制細(xì)胞分裂周期的作用。端粒DNA則是一段單鏈的多重復(fù)非轉(zhuǎn)錄序列5’-(TTAGGG)n- 3’。細(xì)胞每分裂一次，每條染色體的端粒便會缺失一段，當(dāng)缺失到一定程度時，細(xì)胞將會激活凋亡機制，即走向凋亡。研究發(fā)現(xiàn):端粒的長度與人的壽命和疾病有著密切聯(lián)系，因此，測量端粒的長度對研究生命科學(xué)具有重大的意義。
[0003]生物納米通道是現(xiàn)代興起的檢測核酸、多肽、糖類的一種單分子檢測手段，目前應(yīng)用較多的蛋白孔為葡萄球菌α-溶血素(α-hemolysin)、恥垢分枝桿菌(MspA)。但是，由于其自身孔徑的限制，這兩種蛋白通道對于實現(xiàn)DNA分子的微小分辨還存在不足。而氣單胞菌溶素生物納米通道具有更小的孔徑，更高的靈敏度，且其內(nèi)腔帶正電荷，能有效減慢DNA的過孔速率，從而能實現(xiàn)高通量、無標(biāo)記、高靈敏的單分子分析檢測。
[0004]目前，測量端粒長度的方法主要包括DNA印跡法、雜交保護(hù)分析法、熒光原位雜交法、定量PCR法等。所述DNA印跡法需要使用限制性核酸內(nèi)切酶消化DNA，并需要使用同位素或生物素標(biāo)記的端粒特異探針與其進(jìn)行雜交，最終通過光密度計進(jìn)行定量檢測，但是，所得到的端粒長度的數(shù)據(jù)還包括部分亞端粒區(qū)；因此，用DNA印跡法無法測量端粒的真實長度。所述雜交保護(hù)分析法需要使用熒光標(biāo)記的雜交技術(shù)，通過檢測其發(fā)光強度來實現(xiàn)檢測;但是，采用雜交保護(hù)分析法無法得到端粒深層次的信息，也不能測量端粒的實際長度。所述熒光原位雜交法不僅對樣品要求嚴(yán)苛，而且操作過程復(fù)雜，需要進(jìn)行標(biāo)記、雜交，而且也無法得到端粒的絕對長度。所述定量PCR法是通過測量端粒重復(fù)拷貝比例與單個拷貝的基因的比例，即T/S值來得到端粒的平均長度。但是，在實際操作中，上述方法都無法直接測定端粒的長度，既無法檢測端粒的實際長度，又需要進(jìn)行酶切、分子雜交、熒光標(biāo)記等操作，檢測過程相對復(fù)雜。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于解決上述問題，提供一種基于氣單胞菌溶素生物納米通道檢測端粒長度的方法，它無需酶切、分子雜交和熒光標(biāo)記，對DNA底物的消耗量更少，檢測更實時高效，能準(zhǔn)確測量端粒的絕對長度。
[0006]為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案。
[0007]—種基于氣單胞菌溶素生物納米通道檢測端粒長度的方法，其特征在于，包括以下步驟:
(I)打開人類端粒DNA的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)
將人類端粒DNA加入ImL電解質(zhì)溶液，人類端粒DNA的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)在所述電解質(zhì)溶液條件下被打開；
(2)制備氣單胞菌溶素生物納米通道
①活化氣單胞菌溶素
將氣單胞菌溶素溶于胰蛋白酶-EDTA溶液，氣單胞菌溶素與胰蛋白酶-EDTA溶液的比例為l:100;在恒溫箱內(nèi)25°C溫度下放置30min，活化后用TriS-HCl緩沖液、pH=8.0配制并在-20°C冰箱中存儲，儲存濃度為0.lmg/ml;
②配制磷脂正癸烷溶液
在常溫下將I，2_二植烷酰基磷脂溶解于正癸烷溶液中，濃度為25mg/ml;
③制備磷脂雙分子層
采用聚縮醛樹脂檢測池，所述檢測池含有檢測池A(cis端)和檢測池B(trans端)，在所述檢測池A上刻蝕直徑為50μπι(用于磷脂雙分子層趴附)的微孔，再用細(xì)貂毛筆在所述微孔內(nèi)外兩側(cè)均勻涂抹配制好的磷脂正癸烷溶液并用氮氣吹干；
將所述檢測池A與所述檢測池B進(jìn)行組裝，在檢測池A(cis端)加入ImL含人類端粒DNA的電解質(zhì)溶液，在檢測池B( trans端)加入ImL不含人類端粒DNA的電解質(zhì)溶液，將一對Ag/AgCl電極分別浸入所述檢測池的緩沖溶液中，指定檢測池A(cis端)為零電勢點電位，施加400?500mv的跨膜電壓，若磷脂膜在此電壓間被擊破，則認(rèn)為其為能夠形成納米通道的磷脂雙分子層膜；
④形成氣單胞菌溶素生物納米通道
制備好磷脂雙分子層后，在所述檢測池A的微孔近處加入3yL氣單胞菌溶素溶液，施加10mv的跨膜電壓，使氣單胞菌溶素從檢測池A(cis端)自發(fā)嵌入磷脂雙分子層膜;形成單個穩(wěn)定的氣單胞菌溶素生物納米通道，離子流在所述電解質(zhì)溶液的濃度與PH值下發(fā)生50 土5pA的臺階式上升；
(3)用氣單胞菌溶素生物納米通道檢測端粒長度
①采集單分子信號數(shù)據(jù)
在氣單胞菌溶素生物納米通道的兩端施加140mv的跨膜電壓，人類端粒DNA在電場的驅(qū)動下會從檢測池A( cis端)通過氣單胞菌溶素生物納米通道穿至檢測池B( trans端)，進(jìn)而產(chǎn)生大量的與其結(jié)構(gòu)、鏈長相對應(yīng)的電流阻斷信號；
②解析單分子信號數(shù)據(jù)
對采集到的單分子信號的阻斷時間、阻斷電流進(jìn)行解析:
DNA鏈越長，穿過氣單胞菌溶素生物納米通道的時間會越長，即阻斷時間越長；
對采集到的單分子信號的電流阻斷程度進(jìn)行輔助分析，由于DNA分子并非呈完全直線型穿過所述生物納米通道，因而DNA鏈越長，對納米通道造成的阻斷會越大，即電流阻斷程度越大；
每一重復(fù)序列數(shù)不同的人類端粒DNA將得到與其所對應(yīng)的特定阻斷時間值和特定電流阻斷程度值，但當(dāng)重復(fù)序列數(shù)2 3時，電流阻斷程度值產(chǎn)生的變化很微弱，應(yīng)主要基于阻斷時間值進(jìn)行分析;通過分析以上所述阻斷時間值和電流阻斷程度值的參數(shù)，能準(zhǔn)確測定人類端粒DNA的絕對長度。
[0008]可選的，步驟(I)所述的電解質(zhì)溶液為IM氯化鎂(MgCl 2)與I OmM三(羥甲基)氨基甲烷(Tris)、pH=7.4，利用恒溫磁力攪拌器在25°C溫度下攪拌20min混合而成的。在所述氯化鎂溶液中，由于鎂離子不利于G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的形成，人類端粒DNA的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)在所述電解質(zhì)溶液條件下會被打開。
[0009]進(jìn)一步，所述步驟(3)②所述的單分子信號數(shù)據(jù)解析包括以下步驟:
(1)測定一系列不同重復(fù)序列數(shù)的人類端粒DNA—一5’-(TTAGGG)n-3’，其中，η為正整數(shù);統(tǒng)計每一重復(fù)序列數(shù)的人類端粒DNA所對應(yīng)的阻斷時間值和阻斷電流值；
(2)在檢測池A(cis端)電解質(zhì)溶液中加入一定量的細(xì)胞總DNA提取液，制造端粒存在的人體內(nèi)細(xì)胞的真實體系，將一段待測人類端粒DNA加入檢測池A(cis端)，統(tǒng)計所述體系所測得的所有信號數(shù)據(jù)，包括阻斷時間值和阻斷電流值；
(3)將步驟(2)產(chǎn)生的阻斷時間值和阻斷電流值與步驟(I)測得的每一重復(fù)序列數(shù)的人類端粒DNA所對應(yīng)的阻斷時間值和阻斷電流值進(jìn)行對比，即能得出所測人類端粒DNA的重復(fù)序列數(shù)，即端粒的絕對長度。以上所述表明氣單胞菌溶素生物納米通道技術(shù)不僅能在配制的緩沖溶液條件下進(jìn)行檢測，在端粒存在的真實體系中也能實現(xiàn)端粒絕對長度的測定。
[0010]本發(fā)明基于氣單胞菌溶素生物納米通道檢測端粒長度的方法的積極效果是:
提供了一種基于氣單胞菌溶素生物納米通道檢測端粒長度的方法，其與現(xiàn)有方法相比的積極效果是:操作簡單高效，無需酶切，無需分子雜交和熒光標(biāo)記，DNA底物消耗量小，檢測的靈敏度、分辨率極高，價格低廉，能準(zhǔn)確、實時直接測定端粒的絕對長度，對研究生命科學(xué)具有非常積極的意義。
【附圖說明】
[0011]圖1為氣單胞菌溶素生物納米通道檢測單分子的原理圖。
[0012]圖2為實施例1人類端粒DNA(端粒I)穿孔阻斷的信號圖。
[0013]圖3為實施例2人類端粒DNA(端粒2)穿孔阻斷的信號圖。
[0014]圖4為實施例3人類端粒DNA(端粒3)穿孔阻斷的信號圖。
[0015]圖5為實施例4人類端粒DNA(端粒4)穿孔阻斷的信號圖。
【具體實施方式】
[0016]以下結(jié)合附圖介紹本發(fā)明基于氣單胞菌溶素生物納米通道檢測端粒長度的方法的【具體實施方式】，提供5個實施例。但是應(yīng)該指出，本發(fā)明的實施不限于以下的實施方式。
[0017]實施例1
一種基于氣單胞菌溶素生物納米通道檢測端粒長度的方法，包括以下步驟:
(I)打開端粒DNA的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)
所測定的人類端粒DNA為端粒I——5’-TTAGGG -3’。
[0018]將端粒I加入ImL電解質(zhì)溶液，所述電解質(zhì)溶液為IM氯化鎂(MgCl2)與1mM三(羥甲基)氨基甲烷緩沖液(1^8)、？!1=7.4，利用恒溫磁力攪拌器在251溫度下攪拌201^11混合而成的。
[0019]由于G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的形成是陽離子選擇性的，在不同種類的堿金屬鹽溶液中會形成不同的構(gòu)型:在最常用的氯化鉀(KCl)溶液中，鉀離子對G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的形成有促進(jìn)作用，而此結(jié)構(gòu)不利于納米通道對DNA的精確檢測，也會對DNA通過納米通道產(chǎn)生阻礙。
[0020]由于步驟(I)采用的電解質(zhì)溶液不利于G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)的形成，人類端粒DNA的G-四聯(lián)體結(jié)構(gòu)在所述電解質(zhì)溶液條件下會被打開。
[0021](2)制備氣單胞菌溶素生物納米通道，包括以下具體步驟:
①活化氣單胞菌溶素
將氣單胞菌溶素溶于胰蛋白酶-EDTA溶液，氣單胞菌溶素與胰蛋白酶-EDTA溶液的比例為l:100;在恒溫箱內(nèi)25°C溫度下放置30min，活化后用TriS-HCl緩沖液(pH=8.0)配制并在-20°C冰箱中儲存，儲存的濃度為0.lmg/ml。
[0022]②配制磷脂正癸烷溶液
在常溫下將I，2-二植烷?；字芙庥谡锿槿芤褐?，濃度為25mg/ml。
[0023]③制備磷脂雙分子層
檢測池材料采用聚縮醛樹脂;所述檢測池包括檢測池A(cis端)和檢測池B(trans端)，在所述檢測池A上刻蝕有直徑為50μπι的、用于磷脂雙分子層趴附的微孔，再用細(xì)貂毛筆在檢測池A的微孔內(nèi)外兩側(cè)均勻涂抹配制好的磷脂正癸烷溶液并用氮氣吹干。
[0024]將所述檢測池A與所述檢測池B進(jìn)行組裝，在檢測池A(cis端)加入ImL含所述端粒I的電解質(zhì)溶液，在檢測池B( trans端)加入ImL不含人類端粒DNA的電解質(zhì)溶液;再將一對Ag/AgCl電極分別浸入所述檢測池的緩沖溶液中，指定檢測池A(cis端)為零電勢