一種花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒及其檢測方法與應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于植物病毒檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒 及其檢測方法與應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 花生黃色斑點(diǎn)病毒（Groundnut yellow spot virus，GYSV)屬于布尼亞病毒科 (Bunyaviridae)番前斑萎病毒屬(Tospovirus)成員。GYSV最早在印度花生上報(bào)道，隨后在 云南辣椒上也發(fā)現(xiàn)該病毒，該病毒在花生和辣椒上的癥狀均表現(xiàn)為初期葉片上有黃色斑 點(diǎn)，后期黃色斑點(diǎn)逐漸擴(kuò)大成為壞死斑塊，辣椒果實(shí)上的癥狀主要表現(xiàn)為黃化和壞死斑塊。 GYSV在云南辣椒上檢出率不高，主要原因可能與該病毒只能由茶黃硬薊馬傳播，而茶黃硬 薊馬在云南報(bào)道尚少，但是一旦具備適宜的條件該病毒也能大面積爆發(fā)，引起辣椒等作物 的產(chǎn)質(zhì)量損失，因此研究并獲得一種快速鑒定該病毒病原的檢測方法對于該病害的防控技 術(shù)具有重要的意義。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 本發(fā)明的第一目的在于提供一種花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒;第二目的在于提 供所述的花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒的檢測方法;第三目的在于提供所述的花生黃色斑 點(diǎn)病毒檢測試劑盒的應(yīng)用。
[0004] 本發(fā)明的第一目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括盒體、硝酸纖維素膜、顯色液試劑瓶、抗體 試劑瓶、對照試劑瓶； 所述的顯色液試劑瓶包括顯色試劑瓶A和顯色液試劑瓶B; 所述的抗體試劑瓶包括一抗試劑瓶和二抗試劑瓶； 所述的對照試劑瓶包括GYSV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照試劑瓶和GYSV標(biāo)準(zhǔn)陰性對照試劑瓶。
[0005] 本發(fā)明的第二目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，包括以下步驟： 1)根據(jù)檢測樣品數(shù)量剪下硝酸纖維素膜，將硝酸纖維素膜的一角剪去，用以指示膜方 向。
[0006] 2)檢測樣品加入洗滌緩沖液研磨，移液器取2.5 μL研磨液點(diǎn)至硝酸纖維膜方框 中，同時(shí)點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)陽性對照和標(biāo)準(zhǔn)陰性對照，室溫放置或37°C放置至膜徹底干燥； 3) 將膜移至容器，加入封閉緩沖液，室溫或37 °C封閉1 h; 4) 在封閉緩沖液中加入一抗，室溫?fù)u床搖勻，37°C培育1 h或4°C培育過夜； 5) 棄去一抗培育液，洗滌緩沖液洗膜3次，每次5 min; 6) 棄去洗滌緩沖液，加入封閉緩沖液，再在封閉緩沖液中加入二抗，室溫?fù)u床搖勻，37 °C培育1 h或4°C培育過夜； 7) 棄去二抗培育液，洗滌緩沖液洗膜3次，每次5 min; 8) 棄去洗滌緩沖液，顯色緩沖液洗膜1次，每次5 min; 9) 棄去顯色緩沖液，加入顯色液黑暗處顯色，充分顯色后將膜移至清水中終止顯色，分 析并記錄檢測結(jié)果。
[0007] 本發(fā)明的第三目的是這樣實(shí)現(xiàn)的，所述的花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒在檢測花 生黃色斑點(diǎn)病毒中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 通過原核表達(dá)的方法制備了云南辣椒上新topoviruses分離物花生黃色斑點(diǎn)病毒N蛋 白，免疫家兔獲得了高效價(jià)的花生黃色斑點(diǎn)病毒兔抗血清，優(yōu)化并組裝了該新分離物的 dot-ELISA檢測試劑盒，并應(yīng)用于田間樣品的快速檢測，通過該試劑盒的研制，可快速、準(zhǔn) 確、大量的檢測田間疑似樣品中攜帶花生黃色斑點(diǎn)病毒的帶毒情況，為病害防控提供檢測 技術(shù)保障。
【附圖說明】
[0009] 圖1為辣椒植株上GYSV的檢測點(diǎn)樣圖； 圖2為辣椒植株上GYSV的檢測檢測結(jié)果圖。
【具體實(shí)施方式】
[0010]下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以 限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或替換，均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0011] 本發(fā)明所述的花生黃色斑點(diǎn)病毒花生黃色斑點(diǎn)病毒（Groundnut yellow spot virus，GYSV)檢測試劑盒，包括盒體、硝酸纖維素膜、顯色液試劑瓶、抗體試劑瓶、對照試劑 瓶； 所述的顯色液試劑瓶包括顯色試劑瓶A和顯色液試劑瓶B; 所述的抗體試劑瓶包括一抗試劑瓶和二抗試劑瓶； 所述的對照試劑瓶包括GYSV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照試劑瓶和GYSV標(biāo)準(zhǔn)陰性對照試劑瓶。
[0012] 所述的硝酸纖維素膜設(shè)有方格，方格中空白處用以點(diǎn)樣。
[0013] 所述的顯色液試劑瓶A含有NBT顯色液;顯色液試劑瓶B含有BCIP顯色液。
[0014] 所述的NBT顯色液是將0.5g NBT溶于10ml 70%的二甲基甲酰胺;BCIP顯色液是將 0.5g BCIP溶于10ml 100%的二甲基酰胺。
[0015] 所述的一抗試劑瓶含有花生黃色斑點(diǎn)病毒特異性多克隆抗體;二抗試劑瓶含有特 異性羊抗兔。
[0016] 所述的含有花生黃色斑點(diǎn)病毒特異性克隆抗體的制備是采用其N基因原核表達(dá)的 方法得到免疫源，免疫家兔獲得，使用效價(jià)為1:500~20000;花生黃色斑點(diǎn)病毒N基因 PCR擴(kuò) 增引物根據(jù)丁銘（Ding.M.)注冊報(bào)道的GYSV甜椒分離物N基因全序列設(shè)計(jì)（注冊號為： EF528556)，引物序列及其退火溫度具體見下表：
所述的GYSV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照試劑瓶含有感染GYSV的本氏煙植物干粉;GYSV標(biāo)準(zhǔn)陰性對照 試劑瓶含有健康本氏煙植物干粉。
[0017] 本發(fā)明所述的花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒的檢測方法，包括以下步驟： 1)根據(jù)檢測樣品數(shù)量剪下硝酸纖維素膜(例如檢測樣品有5個(gè)，加1個(gè)陽性對照和1個(gè)陰 性對照，應(yīng)剪7個(gè)方格的硝酸纖維素膜），將硝酸纖維素膜的一角剪去，用以指示膜方向。
[0018] 2)檢測樣品加入洗滌緩沖液研磨（1:10~50倍w/v)，移液器取2.5 μL研磨液點(diǎn)至硝 酸纖維膜方框中，同時(shí)點(diǎn)上標(biāo)準(zhǔn)陽性對照和標(biāo)準(zhǔn)陰性對照，室溫放置或37°C放置至膜徹底 干燥； 3) 將膜移至適當(dāng)容器，加入適量封閉緩沖液(根據(jù)膜轉(zhuǎn)入容器確定，例如直徑為20 cm 的培養(yǎng)皿加入25 ml封閉緩沖液），室溫或37 °C封閉1 h; 4) 在封閉緩沖液中加入一抗(加入量根據(jù)一抗使用說明書算得），室溫?fù)u床搖勻，37°C 培育1 h或4°C培育過夜； 5) 棄去一抗培育液，適量洗滌緩沖液洗膜3次，每次5 min(搖床勻搖）； 6 )棄去洗滌緩沖液，加入適量封閉緩沖液，再在封閉緩沖液中加入二抗(加入量根據(jù)二 抗使用說明書算得），室溫?fù)u床搖勻，37 °C培育1 h或4 °C培育過夜； 7) 棄去二抗培育液，適量洗滌緩沖液洗膜3次，每次5 min(搖床勻搖）； 8) 棄去洗滌緩沖液，適量顯色緩沖液洗膜1次，每次5 min(搖床勻搖）； 9) 棄去顯色緩沖液，加入適量顯色液(按顯色液試劑瓶A和顯色液試劑瓶B說明書配制） 黑暗處顯色，充分顯色后將膜移至清水中終止顯色。分析并記錄檢測結(jié)果。
[0019] 本發(fā)明所述的花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒的應(yīng)用為所述的花生黃色斑點(diǎn)病毒 檢測試劑盒在檢測花生黃色斑點(diǎn)病毒中的應(yīng)用。
[0020] 結(jié)果分析方法： 標(biāo)準(zhǔn)陽性對照斑點(diǎn)變?yōu)榧t色、紫紅色或黑色，標(biāo)準(zhǔn)陰性對照斑點(diǎn)不變色，表明實(shí)驗(yàn)過程 正確無誤。檢測樣品斑點(diǎn)變?yōu)榧t色、紫紅色或黑色表明該樣品帶有GYSV，計(jì)作陽性樣品；檢 測樣品斑點(diǎn)不變色表明該樣品不帶有GYSV，計(jì)作陰性樣品。
[0021 ]洗滌緩沖液配方（1 L):
封閉緩沖液配方： 洗滌緩沖液按質(zhì)量體積比(W/ν)加入5%脫脂奶粉混勻。
[0022] 顯色緩沖液配方（100 ml):
顯色液配制方法： 每10 ml顯色緩沖液中加入66 μL顯色液A和33 μL顯色液B混勻。
[0023] 顯色液Α配方:0.5 g ΝΒΤ溶于10 ml 70%的二甲基甲酰胺。
[0024] 顯色液B配方:0.5 g BCIP溶于10 ml 100%的二甲基甲酰胺。
[0025] -抗試劑瓶使用說明：一抗試劑瓶保存在4°C，使用效價(jià)為1:3000。
[0026] 二抗試劑瓶使用說明：二抗試劑瓶保存在4°C，使用效價(jià)為1:8000。
[0027] 對照試劑瓶使用說明：使用前加入2 ml洗滌緩沖液混勻。
[0028] 本發(fā)明所述的花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒設(shè)有盒體、硝酸纖維素膜、顯色液試 劑瓶、抗體試劑瓶、對照試劑瓶和檢測試劑盒說明書，所述硝酸纖維素膜、顯色液試劑瓶、抗 體試劑瓶、對照試劑瓶和檢測試劑盒說明書設(shè)在盒體內(nèi)。制備方法：1)制備硝酸纖維素膜， 所述硝酸纖維素膜上劃有方格，方格中空白處用以點(diǎn)樣;2)制備顯色液試劑瓶，所述顯色液 試劑瓶包括顯色液試劑瓶A和顯色液試劑瓶B;3)制備抗體試劑瓶，所述抗體試劑瓶包括一 抗試劑瓶和二抗試劑瓶，所述一抗為花生黃色斑點(diǎn)病毒特異性多克隆抗體，采用花生黃色 斑點(diǎn)病毒N基因原核表達(dá)的方法得到免疫源，免疫家兔獲得，使用效價(jià)為1:500~20000;所 述二抗為特異性羊抗兔;4)制備對照試劑瓶，所述對照試劑瓶包括GYSV標(biāo)準(zhǔn)陽性對照試劑 瓶和GYSV標(biāo)準(zhǔn)陰性對照試劑瓶;5)制備檢測試劑盒說明書，所述檢測試劑盒說明書包括檢 測方法，洗滌緩沖液配方、封閉緩沖液配方、顯色緩沖液配方、顯色液配制方法、一抗試劑瓶 使用說明、二抗試劑瓶使用說明和對照試劑瓶使用說明。所述花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑 盒可在檢測花生黃色斑點(diǎn)病毒中應(yīng)用。具體包括： A、花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒:花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒設(shè)有盒體、硝酸纖維 素膜、顯色液試劑瓶、抗體試劑瓶、對照試劑瓶和檢測試劑盒說明書，所述硝酸纖維素膜、顯 色液試劑瓶、抗體試劑瓶、對照試劑瓶和檢測試劑盒說明書設(shè)在盒體內(nèi)。
[0029] B、花生黃色斑點(diǎn)病毒檢測試劑盒制備方法： 1) 制備硝酸纖維素膜，所述硝酸纖