測定游離銅的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種測定血清中"游離"銅（即結(jié)構(gòu)上沒有結(jié)合到銅藍(lán)蛋白的血清銅部 分）的新方法。本發(fā)明還涉及一種高敏感度和精確度的測定患有阿爾茨海默氏病的患者的 血清樣品中游離銅的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清銅的測定在大量疾病中是最重要的，例如在阿爾茨海默氏病(AD)中。阿爾茨 海默氏病是一種神經(jīng)性疾病，其特點(diǎn)是記憶力減退和進(jìn)行性癡呆。該疾病出現(xiàn)的原因與β_ 淀粉樣(Αβ)蛋白和Tau肽在大腦內(nèi)的聚集密切相關(guān)。而且，載脂蛋白Ε(ΑΡΟΕ)基因的ε4等位 基因已被證明增加阿爾茨海默氏病的風(fēng)險(xiǎn)。關(guān)于"淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)"，其被公認(rèn)為阿爾茨海 默氏病發(fā)病的最流行假說，最近出現(xiàn)了新的細(xì)節(jié)。事實(shí)上，不同的致病途徑已被假定促進(jìn)阿 爾茨海默氏病的發(fā)病和進(jìn)展。有大量證據(jù)證明氧化應(yīng)激，主要通過金屬氧化還原反應(yīng)，可引 起對(duì)阿爾茨海默氏病的大腦的大腦損傷。具體地，已經(jīng)提出淀粉樣蛋白的超金屬化可以 基于氧化應(yīng)激和過氧化氫生產(chǎn)的氧化還原循環(huán)，確定Αβ蛋白低聚體的形成和沉淀。金屬體 內(nèi)平衡的紊亂導(dǎo)致游離銅的形成，游離銅的形成可能供給大腦銅儲(chǔ)層并進(jìn)入Αβ氧化應(yīng)激循 環(huán)，產(chǎn)生對(duì)阿爾茨海默氏病的多效性。這篇論文現(xiàn)在得到了多方面的證據(jù)支持，這些證據(jù)顯 示游離銅略有增加，但在阿爾茨海默氏病患者的血清中上升顯著。
[0003] 銅藍(lán)蛋白是血液中的主要載銅蛋白質(zhì)，且其在結(jié)構(gòu)上結(jié)合6個(gè)銅原子以形成蛋白 質(zhì)的活性形式，該活性形式占循環(huán)銅的約85-95%，剩余的銅被定義為游離銅。在先前的研 究中，本發(fā)明人常從銅和銅藍(lán)蛋白的測量開始測定血清中的游離銅，計(jì)算如下:血清銅濃度 通過用原子吸收光譜技術(shù)，該技術(shù)利用配備了具有HGA800平臺(tái)的石墨爐的A Aanalyst 300 Perkin Elmer原子吸收分光光度計(jì)，或根據(jù)Abe等人Clin Chem 1989(Randox Laboratories，Cruml in，UK)的比色測定法測量進(jìn)行復(fù)核；銅藍(lán)蛋白的濃度通過根據(jù)Wolf PL Crit Rev Clin Lab Sci 1982的免疫比池法（Horiba ABX，Montpellier，F(xiàn)rance)進(jìn)行 分析，對(duì)于每個(gè)血清銅和銅藍(lán)蛋白對(duì)來說，已經(jīng)根據(jù)Walsh等人Ann Clin Biochem 2003描 述的標(biāo)準(zhǔn)方法計(jì)算了結(jié)合到銅藍(lán)蛋白上的銅(CB)的量和未結(jié)合到銅藍(lán)蛋白上的銅（"游離" 銅）的量。該計(jì)算用ymol/L表達(dá)"游離"銅并基于銅藍(lán)蛋白包含0.3%的銅的證據(jù)。而且，本發(fā) 明人最近描述了測量銅藍(lán)蛋白氧化酶活性的方法，該方法采用鄰聯(lián)茴香胺二鹽酸鹽為底 物。
[0004] 先前，已經(jīng)描述了從商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)（Human Serum Ceruloplasmin，Sigma-Aldrich)的 蛋白質(zhì)氧化酶活性開始測定銅藍(lán)蛋白的量的方法，但是光譜分析顯示蛋白質(zhì)的吸光度峰衰 減，降低了利用酶法檢測以量化蛋白質(zhì)的量的信心，該蛋白質(zhì)的量對(duì)估計(jì)游離銅的值來說 是必須的。
[0005] 基于現(xiàn)有技術(shù)所描述的酶法對(duì)銅和銅藍(lán)蛋白進(jìn)行定量具有一些缺點(diǎn)，如高成本、 市售銅藍(lán)蛋白的可變純度、一般建議采用國際單位(UI)報(bào)告血清酶以及所測定的濃度準(zhǔn)確 度低。
[0006] Hyo Jung Sung等人(J.Am.Chem.Soc.2009)描述了用于測定生物體系中的游離銅 的香豆素探針的合成和使用。
[0007] 本發(fā)明的范圍是提供用于測量血清中的游離銅的新方法和試劑盒，該新方法和試 劑盒沒有現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的是一種用于在體外測定血清樣品中游離銅的濃度的方法，包括以下 步驟：
[0009] (a)將血清樣品裝載在樹脂上進(jìn)行固相萃取，得到結(jié)合級(jí)分和包括游離銅的洗脫 級(jí)分；
[0010] (b)使用香豆素?zé)晒馓结槣y定在步驟a)中洗脫出的級(jí)分中的游離銅的濃度。
[0011] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于在體外測定游離銅的濃度以診斷患者的阿爾茨海默 氏病的方法，該方法包括同樣的步驟a)、步驟b)和將在步驟b)中測定的值與閾值(截止值） 進(jìn)行比較的另一步驟c)，其中較高濃度的游離銅確認(rèn)阿爾茨海默氏病的臨床診斷。
[0012] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于在體外測定游離銅的濃度以預(yù)后患者的阿爾茨海默 氏病的方法，其中在隨后的時(shí)間點(diǎn)對(duì)從患者處收集的血清樣品重復(fù)方法的步驟a)和步驟 b)，并對(duì)這些樣品中的游離銅的濃度隨時(shí)間的進(jìn)展進(jìn)行評(píng)估。
[0013] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是用于在體外測定游離銅的濃度以評(píng)估患有輕度認(rèn)知功能 障礙的患者從輕度認(rèn)知功能障礙的狀態(tài)(MCI)向阿爾茨海默氏病轉(zhuǎn)化的可能性的方法，該 方法包括同樣的步驟a)、步驟b)和將在步驟b)中測定的值與閾值(截止值)進(jìn)行比較的另一 步驟c)，其中較高濃度的游離銅指出從輕度認(rèn)知功能障礙向阿爾茨海默氏病的轉(zhuǎn)化。
[0014] 本發(fā)明的另一個(gè)目的是一種用于檢測血清中的游離銅的試劑盒，包括一個(gè)或多個(gè) 對(duì)固相進(jìn)行層析萃取的裝置和一個(gè)或多個(gè)香豆素?zé)晒馓结槨?br>[0015] 本發(fā)明人觀察到由于血蛋白的存在，對(duì)血清中的游離銅的濃度估計(jì)不準(zhǔn)確;而且， 他們還觀察到從血蛋白中分離低分子量化學(xué)元素的各種方法(例如用膜過濾設(shè)備)不能準(zhǔn) 確測定游離銅的濃度。在本文中所描述的發(fā)明是基于從血蛋白中分離游離銅的步驟的選擇 和熒光探針的特殊種類的選擇。
[0016] 本發(fā)明的方法相比于現(xiàn)有技術(shù)的測定方法具有多個(gè)優(yōu)點(diǎn)：
[0017] -能夠高精度和準(zhǔn)確地測定血清中的游離銅的濃度；
[0018] -允許用非常降低的成本和時(shí)間測定血清中游離銅的濃度；
[0019] -這是一個(gè)易于自動(dòng)化的方法。
【附圖說明】
[0020] 圖 1 ·在Cu++(10-4M)存在下在HEPES:DMS0 9:1 (λ0χ = 43〇ηπι，49Οηπιλ0Μ)中香豆素?zé)晒?探針7-(二乙氨基)-2-氧代-Ν-((吡啶-2-基）甲基)-2Η-色烯-3-甲酰胺的校正曲線。
[0021 ]圖2 ·在Cu++(10-5Μ)存在下在HEPES: DMS0 9:1 (λ0Χ = 430nm，49Οηπιλ0Μ)中香豆素?zé)晒?探針7-(二乙氨基)-2-氧代-Ν-((吡啶-2-基）甲基)-2Η-色烯-3-甲酰胺的校正曲線。
[0022]圖3.受試者工作特征(R0C)曲線。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例對(duì)702個(gè)樣品進(jìn)行了分 許。曲線表明采用本發(fā)明，阿爾茨海默氏病的診斷能夠獲得高特異性(80%)和離散敏感性 (60%)〇
[0023] 圖4.根據(jù)血清游離銅含量預(yù)測受阿爾茨海默氏病影響的患者的惡化概率模型(簡 易精神狀態(tài)檢查）。圓圈代表患者的游離血清銅的值。線代表簡易精神狀態(tài)檢查惡化的預(yù)測 概率的模型。這些患者來自具有高于-0.138的Z值，對(duì)應(yīng)于2. Ιμπιο?/L的游離銅值，比游離銅 值低于該含量的那些患者具有增加的惡化概率的當(dāng)前研究小組。
[0024] 圖5.游離銅濃度還能夠用于預(yù)測抱怨輕度認(rèn)知功能障礙的受試者的百分比，這些 受試者將發(fā)展阿爾茨海默氏病。具有大于1.6μΜ的游離銅濃度的輕度認(rèn)知功能障礙的受試 者具有較高的轉(zhuǎn)化為阿爾茨海默氏病的百分比。
[0025]圖6.根據(jù)一個(gè)實(shí)施例用于實(shí)施本發(fā)明的方法的裝置的照片。
[0026]圖7.通過固相萃取分離的血清樣品的分光光度分析。分光光度分析能夠證實(shí)蛋白 質(zhì)存在于濾液中；越高蛋白質(zhì)的存在，游離銅就回收率方面的性能就越差，因?yàn)檫@些蛋白質(zhì) 遮擋銅讀取。隨著曲線寬度減少，蛋白質(zhì)成分降低，因此游離銅的回收率提高。
[0027]圖8Α和8Β.通過膜過濾分離的血清樣品的分光光度分析。
[0028] 圖9.描述了多項(xiàng)式和"非參數(shù)局部加權(quán)散點(diǎn)平滑"（局部加權(quán)散點(diǎn)平滑）線性回歸 分析，得到依據(jù)現(xiàn)有技術(shù)的參考測試(計(jì)算銅)或依據(jù)根據(jù)本發(fā)明的方法(C4D)測定的未結(jié) 合到銅藍(lán)蛋