一種達(dá)氏鱘受精卵的組織切片方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及顯微組織切片技術(shù)，具體來(lái)說(shuō)就是一種達(dá)氏鋳受精卵的組織切片方法。
【背景技術(shù)】
[0002]達(dá)氏鋳(Acipenser dabryanus)又稱長(zhǎng)江鋳和沙臘子，是我國(guó)特有的淡水定居性鋳科(Acipenseridae)鋳屬魚類，分布于長(zhǎng)江上游和金沙江下游(丁瑞華1994)，國(guó)家I級(jí)重點(diǎn)保護(hù)野生動(dòng)物和長(zhǎng)江上游一級(jí)急切保護(hù)魚類(劉軍2004)，國(guó)際自然保護(hù)聯(lián)盟(WorldConservat1n Un1n，IUCN)極危級(jí)(critically endangered，CR)物種(杜軍等2009)，國(guó)際涉Ii危動(dòng)植物種貿(mào)易公約(Convent1n on Internat1nal Trade in Endangered Speciesof Wild Fauna and Flora，CITES)附錄Π保護(hù)物種，長(zhǎng)江上游珍稀特有魚類國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)的主要保護(hù)對(duì)象之一。近年來(lái)，由于長(zhǎng)江上游江河生態(tài)環(huán)境的惡化，梯級(jí)電站的開發(fā)，本來(lái)就較少的達(dá)氏鋳資源進(jìn)一步下降，現(xiàn)很難發(fā)現(xiàn)、更難捕獲。為了更好地保護(hù)其生物資源，恢復(fù)群體數(shù)量，穩(wěn)定生態(tài)環(huán)境，鋳魚類的生殖研究顯得格外重要。另外在保證種群數(shù)量的情況下，達(dá)氏鋳魚卵可作為魚子醬的重要原料，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，對(duì)經(jīng)濟(jì)發(fā)展和提高人民生活質(zhì)量有一定的貢獻(xiàn)。因此，研究達(dá)氏鋳受精卵具有非常積極意義。
[0003]對(duì)于魚類受精卵的組織切片技術(shù)，主要是以淡水魚類的受精卵作為實(shí)驗(yàn)材料，而且主要是選取的鯉科魚類，比如草魚和鯽魚的受精卵切片技術(shù)，也有較少的海水魚類受精卵切片技術(shù)，比如鲆鰈魚類。而對(duì)于鋳魚類受精卵的相關(guān)技術(shù)尚未見(jiàn)到報(bào)道。淡水魚類的方法是將其受精卵用Bouin’s固定液或者Smith固定液固定后去膜，依據(jù)一般的組織切片方法經(jīng)過(guò)乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋等步驟后，進(jìn)行連續(xù)切片，制成石蠟切片。而海水魚類是參照一般切片方法的基礎(chǔ)上，在脫水之前經(jīng)行了刺破卵膜和瓊脂包埋步驟，增強(qiáng)了脫水和定位。
[0004]在達(dá)氏鋳上，使用上述兩種方法對(duì)其不同發(fā)育時(shí)期的受精卵經(jīng)行處理，出現(xiàn)的情況經(jīng)常是組織切片破碎，卵黃物質(zhì)掉落，卵膜斷裂、分離，不能得到比較完整的切片。其主要原因是達(dá)氏鋳卵卵徑較大，卵膜堅(jiān)韌致密，固定后的卵與大多數(shù)淡水魚類相比其卵周隙非常狹小，不能完整地去膜，而且由于卵周覆蓋一層較厚的粘膜，在脫水、透明、浸蠟的的過(guò)程中不及其他魚類處理充分，在受精卵不同發(fā)育時(shí)期的主要成分的不同，導(dǎo)致切片成功難度極大。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明解決的技術(shù)問(wèn)題是達(dá)氏鋳卵卵徑較大，卵膜堅(jiān)韌致密，固定后的卵與大多數(shù)淡水魚類相比其卵周隙非常狹小，不能完整地去膜，而且由于屬于粘性卵，其卵周覆蓋一層較厚的粘膜，在脫水、透明、浸蠟的的過(guò)程中不及其他魚類處理充分，一般魚類受精卵組織切片方法不適用于鋳魚類，切片成功率較低。
[0006]為解決上述問(wèn)題，我們經(jīng)過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)，包括方法的嘗試，條件的優(yōu)化，時(shí)間的調(diào)整，以及大量的重復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了一套完整的適用于鋳魚類受精卵的連續(xù)組織切片方法，建立了適合鋳魚類受精卵組織切片的方法和條件，針對(duì)于鋳魚受精卵屬于粘性卵，卵黃物質(zhì)豐富，卵膜堅(jiān)韌致密，卵周隙狹小等特點(diǎn)，有效地處理受精卵并制作出較好的石蠟切片。
[0007]本發(fā)明的技術(shù)方案主要由材料固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片與染色七個(gè)步驟組成;所述材料固定采用的固定液為Bouin，s固定液或質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10 %的甲醛固定液;所述脫水時(shí)間為l_2h。所述透明步驟經(jīng)透明液處理后，再分別經(jīng)過(guò)松油醇第一次處理4-5h和松油醇第二次處理5_7h，至鋳魚卵呈透明狀態(tài);所述脫水總時(shí)間為10-20h;所述浸蠟時(shí)間為16-30ho
[0008]所述材料固定步驟為將新鮮的鋳魚卵放入40-60倍體積的Bouin’ s固定液或體積分?jǐn)?shù)為10%的甲醛固定液中固定20-30小時(shí)后，用體積分?jǐn)?shù)為70%乙醇反復(fù)沖洗，然后保存在體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇中，隔一天更換一次體積分?jǐn)?shù)為70%的酒精，連續(xù)三次后保存?zhèn)溆谩?br>[0009]優(yōu)選的，所述材料固定步驟為將新鮮的鋳魚卵放入50倍體積的的Bouin’S固定液中固定或者10%甲醛固定液中固定24小時(shí)后，用70%乙醇反復(fù)沖洗后保存在70%乙醇中，隔一天更換一次70%酒精，連續(xù)三次，以充分洗去固定液，保存?zhèn)溆谩?br>[0010]所述脫水步驟為將70 %乙醇中儲(chǔ)存的鋳魚卵直接浸入80 %乙醇脫水一次，時(shí)間2h，并依次通過(guò)90 %的乙醇脫水一次2h，95 %的乙醇脫水兩次、每次I_2h，100 %的乙醇脫水兩次，每次lh。
[0011]所述透明步驟為先將經(jīng)脫水后的鋳魚卵換到無(wú)水乙醇與松油醇等體積混合的透明液或者松油醇:二甲苯:無(wú)水乙醇=4:1:5的混合透明過(guò)渡液中處理l-3h，然后再分別經(jīng)過(guò)松油醇第一次處理4_5h和松油醇第二次處理5-7h，至鋳魚卵呈透明狀態(tài)。
[0012]所述浸蠟步驟為先將透明處理后的鋳魚卵換到松油醇與石蠟等體積混合的浸蠟液中處理l-2h，然后再分別經(jīng)過(guò)石蠟第一次處理5-8h和石蠟第二次處理10-20h。
[0013]所述包埋步驟為將浸蠟完成后的鋳魚卵用常規(guī)組織包埋方法，即用紙盒進(jìn)行包埋，制成石蠟塊。
[0014]所述切片與染色步驟為通過(guò)切片機(jī)連續(xù)石蠟切片，經(jīng)過(guò)展片、貼片、烤片、后經(jīng)蘇木精伊紅(HE)染色，最后顯微觀察拍照。具體步驟為用切片機(jī)切片，切片厚度控制在5μπι-7μm，經(jīng)35°C_38°C水浴鍋中進(jìn)行展片，用涂有蛋白甘油的載玻片撈片后，在35°C_38°C的烘箱中進(jìn)行烘片。
[0015]蘇木精伊紅(HE)染色法具體步驟如下:先用第一次二甲苯處理10-15min、第二次二甲苯處理10_13min、再用體積比為1:1的二甲苯:無(wú)水乙醇處理2min、第一次100%的乙醇處理2min、第二次100%的乙醇處理2min、第一次95%的乙醇處理2min、第二次95%的乙醇處理2min、80%的乙醇處理2min、70%的乙醇處理2min、蘇木精染色20min、自來(lái)水沖洗3min、I %鹽酸酒精溶液處理5s、水洗后氨水處理15s、再水洗、70 %的乙醇處理3min、80 %的乙醇處理3!11；[11、90%的乙醇處理31]1；[11、伊紅染色308、95%的乙醇處理41]1；[11、第一次100%的乙醇處理4min、第二次100%的乙醇處理4min、用體積比為1:1的無(wú)水乙醇:二甲苯處理5min、第一次二甲苯處理5min、第二次二甲苯處理5min使之透明，然后用中性樹膠封片。
[0016]由附圖1-4可以看出，采用本發(fā)明方法制備的達(dá)氏鋳魚受精卵組織切片，卵膜完整，組織切片完整連片，無(wú)殘缺、重疊，組織結(jié)構(gòu)清晰，層次分明，細(xì)胞界線清楚，染色對(duì)比明顯，未見(jiàn)灰染。
[0017]本發(fā)明的有益效果是:
[0018]1.本發(fā)明建立了適合鋳魚類受精卵組織切片的方法和條件，針對(duì)鋳魚受精卵屬于粘性卵，卵黃物質(zhì)豐富，卵膜堅(jiān)韌致密，卵周隙狹小等特點(diǎn)，本發(fā)明能有效地處理受精卵并制作出較好的石蠟切片。有學(xué)者認(rèn)為Bouin’s固定液固定的受精卵會(huì)出現(xiàn)卵黃物質(zhì)硬而脆的情況，以至于不能連續(xù)切片，也有學(xué)者認(rèn)為Smith固定液固定的效果要比Bouin’s固定液好，不容易使受精卵變硬脆，但是在本發(fā)明中，使用Bou in ’ s固定液或1 %甲醛固定液處理24h左右不會(huì)使卵黃物質(zhì)變硬脆，能夠連續(xù)切片。因此，本發(fā)明可以減少使用Smi th固定液帶來(lái)的繁瑣操作步驟。
[0019]2.本發(fā)明通過(guò)對(duì)脫水時(shí)間的大量探索，確定了最佳的脫水時(shí)間，解決了大部分受精卵組織切片時(shí)不能充分脫水的問(wèn)題。由于鋳魚類受精卵屬于粘性卵，其外周有一層較厚的粘膜，加之其一級(jí)卵膜和二級(jí)卵膜均堅(jiān)韌致密，如果脫水時(shí)間沒(méi)定好，會(huì)導(dǎo)致在脫水時(shí)容易急劇嚴(yán)重皺縮，導(dǎo)致卵周凹凸不平，影響切片。一般方法是剝掉卵膜的方法來(lái)解決這個(gè)問(wèn)題，但是鋳魚類受精卵卵周隙非常狹小，不能剝除，也有通過(guò)用解剖針在卵膜上打孔的方法來(lái)解決，但均增加了操作步驟，而本發(fā)明通過(guò)脫水時(shí)間的控制，不用對(duì)卵膜進(jìn)行特殊的處理，不僅達(dá)到完全脫水的目的，而且保留的卵膜的完整性。
[0020]3.本實(shí)驗(yàn)在鋳魚類受精卵的多個(gè)時(shí)期均經(jīng)行了相同的處理方法，都得到了完整的組織切片，重復(fù)率高，效果好，因此本發(fā)明適用于鋳魚類受精卵各個(gè)時(shí)期的組織切片。
[0021]4.本發(fā)明操作簡(jiǎn)單，合理得當(dāng)，不但適用于鋳魚類受精卵的組織切片，也適用于粘性卵，多卵黃的其他魚類的受精卵組織切片，適用范圍廣泛。
【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1:應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例1進(jìn)行達(dá)氏鋳受精卵的卵裂期組織切片獲得的單個(gè)完整卵切片；
[0023]圖2:應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例1進(jìn)行達(dá)氏鋳受精卵的卵裂期組織切片獲得的卵膜放大昭.
[0024]圖3:應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例2進(jìn)行達(dá)氏鋳受精卵的原腸胚時(shí)期的組織切片切片圖；
[0025]圖4:應(yīng)用本發(fā)明實(shí)施例3進(jìn)行達(dá)氏鋳受精卵期組織切片圖；
[0026]圖5:應(yīng)用對(duì)比實(shí)施例1進(jìn)行達(dá)氏鋳受精卵原腸期組織切片圖；
[0027]圖6:應(yīng)用對(duì)比實(shí)施例2進(jìn)行達(dá)氏鋳受精卵受精卵期組織切片卵膜圖；
[0028]圖7:應(yīng)用對(duì)比實(shí)施例2進(jìn)行達(dá)氏鋳受精卵受精卵期組織切片圖。
【具體實(shí)施方式】
[0029]為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有作出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0030]實(shí)施例1:
[0031 ] 一種達(dá)氏鋳受精卵卵裂期的組織切片方法，由以下步驟組成:
[0032]材料固定:將發(fā)育到受精卵卵裂期的達(dá)氏鋳卵放入50倍體積的Bouin’ s固定液中固定24h，用體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇反復(fù)沖洗，然后保存在70%乙醇中，隔一天更換一次70 %酒精，連續(xù)三次，以充分洗去固定液，保存?zhèn)溆谩?br>[0033]脫水:將保存在70%乙醇