超衍射極限細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)生物物理特性獲取方法與裝置的制造方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及光學(xué)顯微成像和原子力掃描成像不同模態(tài)成像技術(shù)的耦合，特別是一 種超衍射極限細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)生物物理特性獲取方法與裝置。
【背景技術(shù)】
[0002] 在微納米尺度上對細(xì)胞膜上特定及相關(guān)生物學(xué)過程進(jìn)行觀察是近年來的熱點(diǎn)，普 通熒光光學(xué)顯微術(shù)由于對樣本具有無損特點(diǎn)，在活細(xì)胞顯微和檢測研究中占據(jù)重要位置。 然而，由于熒光顯微術(shù)，包括激光共焦掃描顯微術(shù)受到衍射極限制約，空間分辨率都只能接 近半個波長。為了突破衍射極限（超衍射極限），即空間分辨率在200nm以下，近年來各種超 分辨光學(xué)成像技術(shù)，如受激發(fā)射損耗顯微術(shù)STED、隨機(jī)光學(xué)重建顯微術(shù)ST0RM、光活化定位 顯微術(shù)PLAM和結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)S頂?shù)葢?yīng)運(yùn)而生。在上述的幾種超分辨光學(xué)顯微術(shù)中，結(jié)構(gòu) 光照明顯微術(shù)S頂是基于對光的照明方式進(jìn)行改變，即改變系統(tǒng)的光學(xué)傳遞函數(shù)，實(shí)現(xiàn)分辨 率的提高(線性S頂技術(shù)分辨率最高可提高1倍，約為四分之一波長）;此外，S頂技術(shù)還具有 技術(shù)方案簡單、成本較低、成像速度快、光漂白效應(yīng)不明顯等優(yōu)點(diǎn)，使其在l〇〇nm量級的超衍 射分辨率相關(guān)研究如細(xì)胞膜上微區(qū)、細(xì)胞微絲、微管等細(xì)胞器的光學(xué)顯微成像中獲得青睞。
[0003] 原子力顯微術(shù)AFM是掃描探針顯微術(shù)的一種。它是基于探針針尖與樣本表面分子 相互作用的原理，具有很高的橫向和縱向分辨率(Ml量級），可以對樣品表面形貌實(shí)現(xiàn)精確 掃描和成像。在過去的幾十年，AFM技術(shù)已在材料領(lǐng)域獲得了廣泛應(yīng)用。然而原子力探針無 特異性識別能力，而SIM則不具備獲取納米量級超微結(jié)構(gòu)相關(guān)功能信息的能力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 為了實(shí)現(xiàn)對特定區(qū)域微結(jié)構(gòu)和功能信息的獲取，本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提 供一種將結(jié)構(gòu)光照明顯微術(shù)SM和原子力顯微術(shù)AFM有機(jī)融合的超衍射極限細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu) 生物物理特性獲取方法與裝置。
[0005] 為了解決上述問題，本發(fā)明的技術(shù)方案是:一種超衍射極限細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)生物物 理特性獲取裝置，包括激光器和半導(dǎo)體激光器，所述激光器的激光輸出光路依次設(shè)置有偏 振器、第一會聚透鏡組、光闌、第一反射鏡、空間光調(diào)制器、第三會聚透鏡、擋光板、第二會聚 透鏡組和二向色鏡，所述二向色鏡的反射光輸出光路依次設(shè)置有光學(xué)顯微鏡的物鏡和載物 臺，所述二向色鏡的透射光輸出光路依次設(shè)置有濾波片、可切換反射鏡、第六會聚透鏡和 CCD探測器，所述半導(dǎo)體激光器的激光輸出光路依次設(shè)置有第二反射鏡、由三維控制器驅(qū)動 的探針和位置敏感探測器，所述CCD探測器、三維控制器和位置敏感探測器均連接至數(shù)據(jù)采 集控制系統(tǒng)。
[0006] 在本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案中，所述第一會聚透鏡組包含第一會聚透鏡和第二會 聚透鏡。
[0007] 在本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案中，所述第二會聚透鏡組包含第四會聚透鏡和第五會 聚透鏡。
[0008] 在本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案中，所述第一反射鏡輸出的激光束入射到空間光調(diào)制 器的入射角度應(yīng)小于10°。
[0009] 在本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案中，所述擋光板是用于阻擋空間光調(diào)制器0級衍射光 而只允許+1級衍射光和-1級衍射光通過的0級擋光板。
[0010] 為了解決上述問題，本發(fā)明的另一技術(shù)方案是:一種超衍射極限細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)生 物物理特性獲取方法，采用上述的超衍射極限細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu)生物物理特性獲取裝置，將樣 品放置于載物臺上，并按以下步驟進(jìn)行： (1 )SIM成像模態(tài):激光器福射出的激光依次經(jīng)過偏振器、第一會聚透鏡組、光闌、第一 反射鏡、空間光調(diào)制器、第三會聚透鏡、擋光板和第二會聚透鏡組，第二會聚透鏡組輸出的 激光束經(jīng)二向色鏡反射后再依次經(jīng)過物鏡和載物臺，樣品反射回的激光束依次經(jīng)過載物臺 和物鏡后再經(jīng)二向色鏡透射到濾波片，濾波片過濾后的激光束依次經(jīng)過可切換反射鏡和第 六會聚透鏡后由CCD探測器接收光信號，最后由數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)完成圖像采集和數(shù)據(jù)處 理； (2)AFM成像模態(tài):在實(shí)施和完成S頂成像模態(tài)后，將數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)的工作方式切換 到AFM成像模態(tài);在此工作模態(tài)下，由數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)控制三維控制器使探針接近樣品的 選定區(qū)域，并通過倒置的光學(xué)顯微鏡從底部的方向向上觀察探針；由半導(dǎo)體激光器發(fā)射出 的激光經(jīng)過第二反射鏡后從探針上表面反射到位置敏感探測器；當(dāng)探針在樣品表面掃描， 探針會因?yàn)榕c樣品之間的相互作用力而彎曲，激光光斑會隨之偏移，位置敏感探測器接收 到信號，記錄下偏移量，通過信號轉(zhuǎn)換相應(yīng)的生物物理特性參數(shù)，并被數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)所 接收。
[0011] 在本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案中，步驟（1)中的數(shù)據(jù)采集控制系統(tǒng)按以下步驟進(jìn)行 圖像米集： (1.1) 放置好樣品后，在三維控制器上裝上探針，使針尖略浸入樣品的細(xì)胞液面，調(diào)節(jié) 激光光斑在位置敏感探測器上的位置； (1.2) 校準(zhǔn)探針； (1.3) 選定樣品的區(qū)域，做光學(xué)校準(zhǔn)，CCD探測器采集熒光圖像 (1.4) 進(jìn)行亞衍射極限細(xì)胞結(jié)構(gòu)的熒光高分辨成像； (1.5) 設(shè)置空間光調(diào)制器的相位控制圖像，在相位Φ、Φ + Δφ、φ+2Δφ、φ +90°、Φ + 90° + Δ φ和φ+90°+2Δ φ控制的結(jié)構(gòu)光照明下，C⑶探測器依次采集熒光圖像Π 、熒光圖像 ΙΠ 、熒光圖像IV、熒光圖像V、熒光圖像VI和熒光圖像W; (1.6) 重構(gòu)獲得超分辨圖像VI; (1.7) 打開半導(dǎo)體激光器，依據(jù)超分辨圖像珊，調(diào)整探針至樣品所選定區(qū)域位置或目 標(biāo)； (1.8) 關(guān)閉空間光調(diào)制器，選用相應(yīng)AFM工作模式，進(jìn)行AFM數(shù)據(jù)采集。
[0012] 在本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案中，步驟（1.5)中的空間光調(diào)制器按以下步驟進(jìn)行設(shè) 置相位控制圖像： (1.5.1) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設(shè)置為0°相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，調(diào)節(jié)偏振器， 使得擋光板后的+1級衍射光和-1級衍射光達(dá)到最強(qiáng)，CCD探測器采集熒光圖像Π ; (1.5.2) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設(shè)置為Δ φ相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，(XD探測器 采集熒光圖像m; (1.5.3) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設(shè)置為2 Δ φ相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，CXD探測 器采集熒光圖像IV; (1.5.4) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設(shè)置為90°相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，(XD探測器 采集熒光圖像V; (1.5.5) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設(shè)置為90° + Δ φ相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，C⑶探 測器采集熒光圖像VI; (1.5.6) 空間光調(diào)制器的相位控制圖像設(shè)置為90°+2Δ φ相位的結(jié)構(gòu)光照明圖像，（XD 探測器采集熒光圖像W。
[0013] 在本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案中，步驟(1.5.4)調(diào)節(jié)偏振器，使得擋光板后的+1級衍 射光和-1級衍射光達(dá)到最強(qiáng)。
[0014] 在本發(fā)明的進(jìn)一步技術(shù)方案中，步驟(1.6)按以下步驟重構(gòu)獲得超分辨圖像VIII: (1.6.1) 對圖像采集步驟中CCD探測器采集到的6張?jiān)紙D像Π -W進(jìn)行圖像亮度均一 化處理，以消除由于光源強(qiáng)度波動引起的成像亮度的影響； (1.6.2) 對上述處理后的圖像進(jìn)行傅里葉變換操作，獲得相應(yīng)的頻譜信息； (1.6.3) 由各方向的三個相位圖像對應(yīng)頻譜信息，求解3X3的線性方程組，分離出0級、 +1級和-1級頻譜成像信息； (1.6.4) 由分離出0級與+1級或-1級頻譜的重疊區(qū)域的信息確定結(jié)構(gòu)光照明的空間頻 率ko與初始相位Φ ; (1.6.5) 將分尚出的+1級頻譜平移+k〇，將分尚出的-1級頻譜平移_k〇; (1.6.6) 將平移后的+1級和-1級頻譜與0級頻譜疊加合成，并做維納濾波，使得其頻譜 擴(kuò)寬； (1.6.7) 對步驟（1.6.6)得到的擴(kuò)寬的頻譜做傅里葉反變換，獲得(XD探測器采集的超 分辨圖像。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明有機(jī)融合了結(jié)構(gòu)光照明方式顯微 術(shù)SIM和原子力掃描成像AFM二種不同模態(tài)的成像技術(shù)，可以實(shí)現(xiàn)超衍射極限細(xì)胞膜微結(jié)構(gòu) 生物物理特性的信息獲取，對納米生物醫(yī)學(xué)及其相關(guān)研究具有重要意義。
【附圖說明】
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