檢測(cè)食管癌的生物標(biāo)志物的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及腫瘤標(biāo)志物領(lǐng)域，涉及用于食管癌早期診斷的生物標(biāo)志物，具體地，本 發(fā)明提供了可通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)的特征多肽組合作為食管癌早期診斷的生物標(biāo)志物。
【背景技術(shù)】
[0002] 食管癌是在全世界范圍內(nèi)的第八大最常見(jiàn)的癌癥，按照與癌癥有關(guān)的致死原因排 序，食管癌排在第六位。盡管目前各國(guó)醫(yī)療科研機(jī)構(gòu)對(duì)食管癌的診斷、治療的研究都有所進(jìn) 展，但它的五年生存率平均只有15%，仍然缺乏可靠的診斷方法、早期檢測(cè)方法和有效的個(gè) 體化治療方案，并且預(yù)后效果差。據(jù)研究報(bào)導(dǎo)，處于早期階段的腫瘤，如果切除成功，會(huì)使食 管鱗狀細(xì)胞癌患者的5年總生存率超過(guò)90%，表明早期診斷和治療可降低病死率。目前用于 識(shí)別食管癌患者的生物標(biāo)志物，在癌癥早期階段還缺乏足夠的靈敏度和特異性。
[0003] 目前食管癌的檢測(cè)仍然停留在臨床表征檢測(cè)水平，缺乏早期預(yù)警的技術(shù)手段。近 年來(lái)也出現(xiàn)了一些新型質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，如：中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)200510075367、"一種在食管癌病 人血清中檢測(cè)腫瘤相關(guān)標(biāo)志物的方法"公開(kāi)了一種在食管癌病人血清中檢測(cè)腫瘤相關(guān)標(biāo)志 物的方法，包括:蛋白免疫印跡證實(shí)Ku70蛋白為食管癌特異的腫瘤相關(guān)標(biāo)志物，制備該標(biāo)志 物的抗體，然后利用該標(biāo)記物檢測(cè)病人血樣，并通過(guò)SDS-PAGE電泳，分離腫瘤特異表達(dá)的蛋 白條帶，進(jìn)行電噴霧離子化偶聯(lián)在線離子阱質(zhì)譜蛋白屬性鑒定，最終實(shí)現(xiàn)檢測(cè)目的。然而該 方法涉及免疫組織化學(xué)方法、電泳分離純化法，最終才進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)，過(guò)程耗時(shí)費(fèi)力，影響 了臨床檢測(cè)效果。
[0004] 中國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)201210479435、"一種食管癌免疫質(zhì)譜檢測(cè)試劑盒"則公開(kāi)了另一 種質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，包括:將特定單克隆抗體結(jié)合到檢測(cè)載體上，吸附樣品中的待分析物，然 后收集待分析物進(jìn)行質(zhì)譜檢測(cè)。該方法仍然屬于傳統(tǒng)的免疫吸附分離聯(lián)合質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)， 由于前期的分離過(guò)程過(guò)于傳統(tǒng)和復(fù)雜，涉及制備特定單抗和抗體/抗原的孵化結(jié)合等過(guò)程， 無(wú)法實(shí)現(xiàn)食管癌的早期、快速準(zhǔn)確診斷和微量檢測(cè)的技術(shù)效果。
[0005] 基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(Matrix Assisted Laser Desorption Ionization Time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS)是近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的一 種新型的軟電離生物質(zhì)譜，其原理是用激光照射樣品與基質(zhì)形成的共結(jié)晶薄膜，基質(zhì)從激 光中吸收能量傳遞給生物分子，而電離過(guò)程中將質(zhì)子轉(zhuǎn)移到生物分子或從生物分子得到質(zhì) 子，從而使生物分子電離的過(guò)程。T0F的原理是離子在電場(chǎng)作用下加速飛過(guò)真空飛行管道， 根據(jù)到達(dá)檢測(cè)器的飛行時(shí)間不同來(lái)檢測(cè)離子，即被檢測(cè)離子的質(zhì)荷比(m/z)與該離子的飛 行時(shí)間成正比。盡管MALDI-T0F的準(zhǔn)確度高達(dá)0.1 %~0.01%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于目前常規(guī)應(yīng)用的十 二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)與高效液相色譜技術(shù)，但迄今為止尚無(wú)采用 MALDI-T0F-MS技術(shù)獲得檢測(cè)食管癌標(biāo)志物或食管癌血清特征多肽的報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的發(fā)明人基于質(zhì)譜檢測(cè)技術(shù)，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)了可用于食管癌診斷的生物 標(biāo)志物，該生物標(biāo)志物可靈敏、準(zhǔn)確地診斷食管癌或評(píng)估罹患食管癌的風(fēng)險(xiǎn)，由此完成了本 發(fā)明。
[0007] 本發(fā)明第一方面涉及生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合，其包括選自質(zhì)荷比為1925.5 ±3·Om/z(例如±2·Om/z、± 1 ·Om/z、±0· 2m/z)、2950.6±3.Om/z(例如±2·Om/z、± 1 ·0m/ z、±0 · 3m/z)、5900·0±3 ·Om/z(例如±2·Om/z、± 1 .Om/z、±0·6m/z)的多肽中的一種、兩種 或三種，優(yōu)選地，
[0008] 所述質(zhì)荷比為1925.5±3.〇111/2的多肽具有如下所示的序列：]\^卜617,31，31-Ser-Leu-Gly-Ser-Pr〇-Ser-Gly-Glu-Val-Ser-His-Pr〇-Arg-Lys-Thr(SEQ ID NO:1);
[0009] 所述質(zhì)荷比為2950.6± 3. Om/z的多肽具有如下所示的序列：六811-六作-116-?1'〇-Glu-Ser-Gly-Gly-Asp-Asn-Ser-Val-Phe-Asp-Ile-Phe-G lu-Leu-Thr-Gly-Ala-Ala-Arg-Lys-Gly-Ser-Gly-Arg(SEQ ID N0:2)；
[0010] 所述質(zhì)荷比為5900.0±3. Om/z的多肽具有如下所示的序列 ：Ser-Ser-Ser-Tyr-Ser-Lys-Gln-Phe-Thr-Ser-Ser-Thr-Ser-Tyr-Asn-Arg-Gly-Asp-Ser-Thr-Phe-Glu-Ser-Lys-Ser-Tyr-Lys-Met-Ala-Asp-Glu-Ala-Gly-Ser-Glu-Ala-Asp-His-Glu-Gly-Thr-His-Ser-Thr-Lys-Arg-Gly-His-Ala-Lys-Ser-Arg-Pr〇-Val(SEQ ID N0:3)〇
[0011] 在本發(fā)明的實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合用于以下用途中的一 種或數(shù)種：1)評(píng)估食管癌的患病風(fēng)險(xiǎn);2)食管癌的診斷；3)篩選治療食管癌的藥物;和4)評(píng) 估藥物對(duì)食管癌的治療效果。
[0012] 在本發(fā)明的具體實(shí)施方案中，所述食管癌為食管鱗狀細(xì)胞癌，例如為早期食管鱗 狀細(xì)胞癌，例如為T(mén)NM分期I期食管鱗狀細(xì)胞癌。
[0013] 本發(fā)明第二方面涉及試劑組合物，其含有用于檢測(cè)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生物 標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合的試劑。
[0014] 在本發(fā)明中，所述用于檢測(cè)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組 合的試劑為本領(lǐng)域所公知，或者可以根據(jù)本領(lǐng)域的技術(shù)常識(shí)制備得到，例如可以為能夠與 所述的生物標(biāo)志物特異性結(jié)合的抗體或配體。
[0015] 本發(fā)明第三方面涉及試劑盒，其含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生物標(biāo)志物或生物 標(biāo)志物組合或第二方面任一項(xiàng)的試劑組合物。
[0016] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合可以作為標(biāo)準(zhǔn) 品。
[0017] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其還含有用于質(zhì)譜檢測(cè)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的 生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合的試劑。
[0018] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述用于質(zhì)譜檢測(cè)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生 物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合的試劑包括能夠和多肽結(jié)合的物質(zhì)，例如弱陽(yáng)離子磁珠或弱陽(yáng) 離子交換柱，以及任選的緩沖液、洗滌液和洗脫液。
[0019] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述的能夠和多肽結(jié)合的物質(zhì)為弱陽(yáng)離子 磁珠;所述磁珠可以使用市售的，例如美國(guó)Bruker公司的WCX2磁珠試劑盒，或者申請(qǐng)人研制 的SPE-C磁珠試劑盒（專(zhuān)利號(hào)ZL2008101879684)。
[0020] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其還含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生物標(biāo)志物或生 物標(biāo)志物組合的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)(例如食管癌患者的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)）的軟件或芯片，可用于待測(cè)樣 品進(jìn)行質(zhì)譜時(shí)提供標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)或標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對(duì)，以判斷待測(cè)樣品中所述的生物標(biāo)志物或其 組合的有無(wú)或含量。
[0021] 本發(fā)明第四方面涉及試劑盒，其含有說(shuō)明書(shū)，所述說(shuō)明書(shū)記載了該試劑盒的用途 以及使用方法，
[0022] 所述用途選自以下用途中的一種或數(shù)種：1)評(píng)估食管癌的患病風(fēng)險(xiǎn);2)食管癌的 診斷;3)篩選治療食管癌的藥物;和4)評(píng)估藥物對(duì)食管癌的治療效果；
[0023]所述使用方法包括利用質(zhì)譜檢測(cè)選自以下質(zhì)荷比為1925.5± 3.0m/z(例如土 2 · Om/z、± 1 · Om/z、± 0 · 2m/z)、2950.6±3. Om/z (例如 ± 2 · Om/z、± 1 · Om/z、± 0 · 3m/z)、 5900 · 0±3 · Om/z(例如±2 · Om/z、± 1 · Om/z、±0 · 6m/z)的多肽中的一種、兩種或三種的步 驟。
[0024] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還含有含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生 物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合或第二方面任一項(xiàng)的試劑組合物。
[0025] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，所述生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合可以作為標(biāo)準(zhǔn) 品。
[0026] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其還含有用于質(zhì)譜檢測(cè)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生 物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合的試劑。
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其中所述用于質(zhì)譜檢測(cè)本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生 物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合的試劑包括能夠和多肽結(jié)合的物質(zhì)，例如弱陽(yáng)離子磁珠或弱陽(yáng) 離子交換柱，以及任選的緩沖液、洗滌液和洗脫液。
[0028] 在本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案中，其中所述的能夠和多肽結(jié)合的物質(zhì)為弱陽(yáng)離子 磁珠;所述磁珠可以使用市售的，例如美國(guó)Bruker公司的WCX2磁珠試劑盒，或者申請(qǐng)人研制 的SPE-C磁珠試劑盒（專(zhuān)利號(hào)ZL2008101879684)。
[0029] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，其還含有本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生物標(biāo)志物或生 物標(biāo)志物組合的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)(例如食管癌患者的標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)）的軟件或芯片，可用于待測(cè)樣 品進(jìn)行質(zhì)譜時(shí)提供標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)或標(biāo)準(zhǔn)曲線的比對(duì)，以判斷待測(cè)樣品中所述的生物標(biāo)志物或其 組合的有無(wú)或含量。
[0030] 本發(fā)明第五方面涉及本發(fā)明第一方面任一項(xiàng)的生物標(biāo)志物或生物標(biāo)志物組合、或 者第二方面任一項(xiàng)的試劑組合物在制備產(chǎn)品中的用途，所述產(chǎn)品通過(guò)對(duì)受試者待測(cè)樣品的