一種痕量甲苯咪唑殘留檢測時(shí)間分辨熒光免疫試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于免疫學(xué)檢測領(lǐng)域，具體來說，涉及到一種用于痕量甲苯咪唑殘留檢測的時(shí)間分辨熒光免疫試劑盒及其制備方法。應(yīng)用于對動物源食品，尤其是肉類產(chǎn)品中痕量甲苯咪唑殘留的檢測。
【背景技術(shù)】
[0002]甲苯咪唑?yàn)橐粋€(gè)廣譜驅(qū)腸蟲藥，體內(nèi)或體外試驗(yàn)均證明能直接抑制線蟲對葡萄糖的攝入，導(dǎo)致糖原耗竭，使它無法生存，具有顯著的殺滅幼蟲、抑制蟲卵發(fā)育的作用，可用于防治鉤蟲、蛔蟲、蟯蟲、鞭蟲、糞類回線蟲等腸道寄生蟲病,動物試驗(yàn)表明本品可致畸，因此動物食品中的甲苯咪唑殘留對人類的健康構(gòu)成了巨大威脅。
[0003]現(xiàn)有檢測方法中最常用的為GC/MS方法，由于這種化合物含量低，且樣品基質(zhì)大多比較復(fù)雜，因此在進(jìn)行儀器定量分析之前，通常需要一定的分離富集凈化程序(固相萃取，SPE)，但是缺點(diǎn)明顯:分析時(shí)間較長、檢測所需樣品量較大、及繁瑣的前處理步驟等缺點(diǎn)，不適宜于大量樣品的快速測定。與此相比，免疫學(xué)方法具有快速、無需樣品前處理等特點(diǎn)，可以作為一種高效的篩選方法。普通ELISA方法靈敏度較低，而且一些復(fù)雜基質(zhì)對方法本身有較大干擾，而時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TRFIA)方法具有極其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，不需樣品前處理，且靈敏度高，可以滿足測定動物源性食品中痕量甲苯咪唑殘留的要求。
[0004]時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TRFIA)是以稀土絡(luò)合物作為標(biāo)記物的新型免疫分析技術(shù)，它根據(jù)鑭系元素螯合物的發(fā)光特點(diǎn)，用時(shí)間分辨技術(shù)測量熒光以排除非特異熒光的干擾。其發(fā)光機(jī)理為:配體分子吸收激發(fā)光后由基態(tài)躍遷至激發(fā)單線態(tài)，然后通過系間竄躍至配體的激發(fā)三線態(tài)。此時(shí)三線態(tài)的激發(fā)能高于稀土離子所處能級時(shí)，能量就傳遞給稀土離子。當(dāng)稀土離子接受傳遞來的能量后被激發(fā)至共振能級，并在由共振能級躍遷回基態(tài)過程中發(fā)出熒光，表現(xiàn)為稀土離子的特征熒光。這種發(fā)光是基于配合物內(nèi)由配體到中心離子的能量轉(zhuǎn)移所產(chǎn)生的。因此，與普通有機(jī)熒光標(biāo)記物具比具有以下優(yōu)勢:
I)激發(fā)光譜帶較寬。有利于增加激發(fā)能，提高標(biāo)記物的比活性。
[0005]2)發(fā)射光譜帶甚窄。半峰寬小于15nm，有利于降低本底熒光強(qiáng)度，提高分辨率。
[0006]3) Stokes位移(最大激發(fā)光波長與最大發(fā)射光波長之差)大。稀土絡(luò)合物的最大激發(fā)光波長通常在250-380 nm的紫外區(qū)，最大發(fā)射光波長在500nm以上。Stokes位移有250-350 nm，十分有利于排除非特異熒光的干擾，增強(qiáng)熒光信號測量的特異性。
[0007]4)激發(fā)波長具有絡(luò)合劑的性質(zhì)，即隨絡(luò)合劑的變化而變化；而發(fā)射波長具有鑭系元素的性質(zhì)，即不隨絡(luò)合劑的變化而變化。銪(europium, Eu)、鋮(terbium, Tb)和釤(samarium, Sm )這三種鑭系兀素的最大發(fā)射波長分別約為615 nm、545 nm和643 nm。
[0008]因?yàn)楸尘盁晒獾膲勖荚?-10 ns之間。稀土配合物與普通有機(jī)熒光標(biāo)記物相比的一個(gè)最突出的特征是它極長的熒光壽命(100 μ S以上)，所以采用時(shí)間分辨熒光測定技術(shù)，只測定長壽命熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，而不測定短壽命熒光物質(zhì)發(fā)出的熒光，就可以很好地消除背景，極大地提高測定靈敏度。
[0009]時(shí)間分辨熒光免疫包括Cyber Fluor體系和DELFIA體系兩種系統(tǒng):
Cyber Fluor體系是1986年由Evangelista等建立的以配基為標(biāo)記物的非均相TRFIA體系。這類化合物含有菲咯琳環(huán)，能高效地向Eu3+傳遞激發(fā)能；又有類似多胺多羧基的結(jié)構(gòu)，能與Eu3+形成穩(wěn)定的絡(luò)合物；還有活性基團(tuán)可以與蛋白質(zhì)偶聯(lián)，所以有較廣的應(yīng)用范圍。這種方法的主要優(yōu)點(diǎn)是對污染不敏感，使用通用免疫試劑即可適用于各種免疫分析，此法也可以給出空間定位信息；此方法的缺點(diǎn)是靈敏度較低。這是因?yàn)橐话阋笈浠^量才能獲得鑭系螯合物的高強(qiáng)度熒光，而在本方法中是鑭系離子過量而配基不足。當(dāng)然，該體系可以在生物素一親和素信號放大的基礎(chǔ)上，通過采用SBMC作為信號生成試劑使熒光信號得以成萬倍的放大，以有效彌補(bǔ)體系檢測靈敏度不足的問題。
[0010]DELFIA (Dissociat1n Enhanced Lanthanide Fluoroimmunoassay)體系主要是芬蘭Wallac生化實(shí)驗(yàn)室(現(xiàn)Perkin-Elmer Life Sciences公司)研究并開發(fā)出來的。此系統(tǒng)是利用具有雙功能基團(tuán)的螯合劑將鑭系元素標(biāo)記到抗原或抗體上，經(jīng)免疫反應(yīng)與抗體或抗原形成免疫復(fù)合物，即稀土離子-螯合劑-抗原〔抗體)螯合物。它采用螯合劑為多胺多羧基類絡(luò)合劑，常用的如乙二胺四乙酸(H)TA)、二乙三胺四乙酸(DTTA)和二乙三胺五乙酸(DTPA)等化合物的衍生物。
[0011]DTPA、EDTA、DTTA等化合物為雙功能鰲合劑，一端螯合Eu'另一端與蛋白質(zhì)的氨基連接。在中性或接近中性PH值的條件下，對Eu3+具有足夠高的絡(luò)合穩(wěn)定性，而在酸性條件下，又能將螯合的Eu3+釋放出來。由于這種結(jié)合物本身在水中熒光極弱，因此加入一種增強(qiáng)劑(Fluorescence enhancement solut1n, FES),使Eu3+完全從絡(luò)合物上解離下來，并迅速與增強(qiáng)液中的配體絡(luò)合并進(jìn)入膠束的疏水內(nèi)核，這種分子團(tuán)在紫外光的激發(fā)下能發(fā)出很強(qiáng)的熒光，信號增強(qiáng)了百萬倍，實(shí)現(xiàn)了從配位體到鑭系元素離子高效率能量傳遞。此系統(tǒng)的特點(diǎn)是把實(shí)現(xiàn)抗體穩(wěn)定標(biāo)記和提高熒光強(qiáng)度分開處理。
[0012]本發(fā)明基于這種時(shí)間分辨熒光免疫分析技術(shù)(TRFIA)，研制了高靈敏的CAP單抗，并對增強(qiáng)液進(jìn)行了改進(jìn)，在此基礎(chǔ)之上，形成了用于檢測動物源食品甲苯咪唑殘留的試劑盒產(chǎn)品，并建立了可快速、靈敏、高通量測定動物源性食品中痕量甲苯咪唑殘留的分析方法。
[0013]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0014](一)本發(fā)明要解決的技術(shù)問題
本發(fā)明目的在于提供一種結(jié)構(gòu)簡單、使用方便、價(jià)格便宜、便于攜帶、靈敏度更高的用于動物源食品中痕量甲苯咪唑殘留檢測的時(shí)間分辨熒光免疫試劑盒，并提供一種高效、準(zhǔn)確、靈敏、適合大量篩選的定量檢測方法。本發(fā)明與ELISA方法相比，更加靈敏、高效，可以避免一些基質(zhì)物質(zhì)的干擾。
[0015](二)本發(fā)明的技術(shù)方案
為解決所述問題，本發(fā)明綜合采用時(shí)間分辨熒光技術(shù)、蛋白質(zhì)偶聯(lián)和生物化學(xué)制備等技術(shù)制備了用于痕量甲苯咪唑殘留檢測的時(shí)間分辨熒光免疫試劑盒。將甲苯咪唑與載體蛋白偶聯(lián)制備成人工免疫抗原和包被抗原；用人工免疫抗原免疫動物制備抗甲苯咪唑的單克隆抗體；將甲苯咪唑包被抗原包被吸附于固相載體上；將檢測用的試劑配置成可直接使用的試劑。使用時(shí)，將甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品或待測樣品和Eu3+標(biāo)記的甲苯咪唑單抗混合后與固相載體上的抗原競爭結(jié)合，洗滌去除游離的抗原抗體復(fù)合物，加入增強(qiáng)液，于ARCUS-1230時(shí)間分辨熒光儀中，設(shè)定好相關(guān)參數(shù)，測定熒光強(qiáng)度。
[0016]本時(shí)間分辨熒光免疫試劑盒，由下列成分組成:
(I)包被了甲苯咪唑藥物抗原的酶標(biāo)板，
(2 ) Eu3+標(biāo)記的甲苯咪唑單抗，
(3)甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，
(4)洗滌緩沖液，
(5)標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，
(6)突光增強(qiáng)液，
其中包被了甲苯咪唑藥物抗原的酶標(biāo)板有24孔、或48孔、或96孔。
[0017]其中(I)所述的包被了甲苯咪唑藥物抗原的酶標(biāo)板，按照下述方法制備得到: a、甲苯咪唑藥物抗原的合成
將甲苯咪唑藥物分子結(jié)構(gòu)中的醇羥基采用戊二酸酐?；?，再與卵清蛋白(OVA)和牛血清白蛋白(BSA)等載體蛋白采用水溶性碳化二亞胺法(EDC)在不同的溶劑中進(jìn)行偶聯(lián)得到免疫原。本發(fā)明合成的免疫原采用免疫電泳測定其純度為98.8%。
[0018]b、酶標(biāo)板的包被
包被抗原以合適濃度與包被緩沖液混合，添加于酶標(biāo)板中且置于室溫下反應(yīng)14 h。用洗滌緩沖液洗滌3次后，用封閉緩沖液在37°C進(jìn)行封閉(約I h)，去除孔內(nèi)液體，干燥后用鋁膜真空密封保存。
[0019]C、所用緩沖液配方為:
包被緩沖液為0.1 mol/L碳酸緩沖液，ρΗ7.8，含0.05% NaN3,0.9% NaCl。
[0020]封閉液為0.05 mol/L Tris-HCl 溶液，ρΗ8.0,含0.5% BSA, 0.9% NaCl，0.04% NaN30
[0021]洗滌緩沖液為0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.9% NaCl，0.04% Tween20。
[0022]其中(2)所述的Eu3+標(biāo)記的甲苯咪唑單抗，按照下述方法制備得到:
a、甲苯咪唑單克隆抗體制備
動物免疫程序:采用甲苯咪唑人工抗原為免疫原，免疫BALB/C小鼠，免疫劑量為50μ g，首次免疫為含弗氏完全佐劑的免疫原，以后每隔四周，用含弗氏不完全佐劑的免疫原加強(qiáng)免疫，前后共四次，可以得到血液里含有甲苯咪唑藥物特異性抗體的小鼠；最后一次免疫后10天,采血,取脾細(xì)胞。
[0023]細(xì)胞融合與克隆化:取免疫BALB/C小鼠脾細(xì)胞與小鼠骨髓瘤細(xì)胞雜交融合,制備雜交瘤細(xì)胞，采用間接競爭酶聯(lián)免疫方法測定細(xì)胞上清液，篩選陽性孔。利用有限稀釋法對陽性孔進(jìn)行克隆化，篩選能穩(wěn)定分泌甲苯咪唑單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。
[0024]單克隆抗體的制備與純化:采用體內(nèi)誘生法，將BALB/C小鼠腹腔注入滅菌石蠟油，7-14天后腹腔注射雜交瘤細(xì)胞，7-10天后采集腹水，經(jīng)硫酸銨鹽析純化，分裝待用，-20°C保存。
[0025]b、Eu3+標(biāo)記的甲苯咪唑單抗制備
甲苯咪唑抗體用包被緩沖液透析2次，每次24 h，然后與I mg DTTA- Eu3+混合于棕色小瓶中進(jìn)行反應(yīng)。反應(yīng)所得的Eu3+標(biāo)記甲苯咪唑抗體以凝膠Sephadex 6B/G-50純化,并以洗滌緩沖液進(jìn)行洗脫。純化的Eu3+標(biāo)記的甲苯咪唑單抗加入0.1% BSA和0.04% NaN3。
[0026]其中(3)所述的甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)品，按照下述方法制備得到:
甲苯咪唑標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:準(zhǔn)確稱取標(biāo)準(zhǔn)甲苯咪唑I mg，精確到0.00001 g，配成I yg/mL標(biāo)準(zhǔn)品溶液母液；使用時(shí)，用標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液稀釋成所需的濃度(10-1000 ng/mL)。
[0027]其中(4)所述的洗滌緩沖液，按照下述方法制備得到:
洗滌緩沖液為 0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.9% NaCl，0.04% Tween20。
[0028]其中(5)所述的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液，按照下述方法制備得到:
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液為0.05 mol/L Tris-HCl, pH 8.0,0.9%NaCl的緩沖液。
[0029]其中(6)所述的熒光增強(qiáng)液，按照下述方法制備得到:
熒光增強(qiáng)液為0.1 mol/L鄰苯二甲酸氫鉀一乙酸緩沖液，含15 umol/L β-ΝΤ