速，適用于大批量樣品的檢測。
【附圖說明】
[0015] 圖1為鄰苯二甲酸二丁酯標準曲線圖。
【具體實施方式】
[0016] 檢測鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA試劑盒，包括酶標板、鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA 標準品、鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA抗體工作液、鄰苯二甲酸二丁酯酶標二抗工作液、底物 液A、底物液B、終止液利濃縮洗滌液。
[0017] 下面具體描述本發(fā)明中檢測鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA試劑盒的制備。
[0018] 鄰苯二甲酸二丁酯蛋白質偶聯(lián)物的制備： 選用4-硝基鄰苯二甲酸為原料，4-硝基鄰苯二甲酸和正丁醇在濃硫酸催化下合成 4-硝基鄰苯二甲酸二丁酯，然后在酸性條件下，以鋅為催化劑合成4.氨基鄰苯二甲酸二丁 酯，然后經(jīng)重氮化并分別與BSA和0VA偶聯(lián)，繼而合成免疫原與檢測原。
[0019] 鄰苯二甲酸二丁酯單克隆抗體的制備： 本實驗采用重氮化法合成DBAP-BSA人工抗原，取6-8周齡BALB/c小鼠3只，免疫劑 量150ug/只，采用腹腔注射、背部皮下多點注射等方法，在三免、五免后一周斷尾采血，用 ELISA方法檢測血清效價，待血清效價穩(wěn)定，六免后7d加強免疫，3d后可進行細胞融合實 驗。利用單克隆抗體技術及酶聯(lián)免疫檢測技術篩選出能夠穩(wěn)定分泌DBP單克隆抗體的雜交 瘤細胞株，經(jīng)過三次亞克隆篩選，進行擴大培養(yǎng)并凍存細胞株。采用體內誘生法制備腹水， 建立ELISA方法，檢測腹水和細胞培養(yǎng)上清中抗體的效價和特異性。
[0020] 酶標鄰苯二甲酸二丁酯的制備： 將25%戊二醛用0.05mol/L pH9. 6的碳酸鹽緩沖液（CBS)稀釋至5%，稱取5 mg HRP 溶于0.5 mL 5%的戊二醛，37°C水浴結合2 h，加入0. 15 mol/L NaCl 1.0 mL，充分混勻 后，置4°C預冷10 min。加入無水乙醇2. 4 mL，顛倒混合，立即1000 r/min離心10min; 棄掉上清，沉淀用冷的75%乙醇洗一次，將離心管倒置，風干。加入0.05mol/L pH 9. 6的 CBS 0. 5mL溶解沉淀物；將5 mg PEA抗休溶于0. 5mL 0. 15mol/LNaCl，再與醛化HRP溶液混 合，加入1. 0 mol/L pH9. 6的CBS溶液，調節(jié)pH至9. 0-9. 5,于4°C下，電磁攪拌結合24h。 加入0. lmLO. 15mol/L賴氨酸，以封閉殘留的醛基，終止反應，放置丁 4°C下2 h:將反應物 通過Sephadex G-200凝膠柱，用PBS洗脫，收集第一洗脫峰；或將反應物裝入透析袋，用 0. 01mol/L pH7. 2PBS，4°C透析過夜并收集。即為酶標記抗體。
[0021] 制備包被有鄰苯二甲酸二丁酯包被抗原的酶標板： 酶標板包被鄰苯二甲酸二丁酯抗原，包被抗原是將鄰苯二甲酸二丁酯半抗原與載體蛋 白偶聯(lián)得到的，該載體蛋白為雞卵清白白蛋白（0VA)，用0· 2mol/L Na2C03 8mL，與0· 2mol/ L NaHC03 17mL混合，再加75mL雙蒸水，調pH值到9. 6的碳酸鹽（CBS)緩沖液作為包被液， 將 0.2mol/L Na2C03 8mL，與 0.2mol / L NaHC03 17mL 混合，再加 75mL 雙蒸水，調 pH 值到 9. 6的碳酸鹽（CBS)緩沖液作為包被液，抗原稀釋成1 :4000比例，100 uL/孔，37°C放置2 h，取出酶標板拍掉板內液體，用稀釋后的濃縮洗滌液300 uL/孔，洗板2次，30 s/次；然后 加入10%牛血清白蛋白（BSA)封閉，180 u L/孔，37°C放置1.5h，棄去封閉液，拍干后的酶 標板放置恒溫間（25°C)晾干，抽檢合格后將酶標板真空密封后置4°C下保存。
[0022] 所述鄰苯二甲酸二丁酯的標準品配制濃度分別為0 ng/mL、0. 5ng/mL、lng/mL、 1. 5ng/mL、2ng/ml、2. 5ng/mL〇
[0023] 鄰苯二甲酸二丁酯蛋白質偶聯(lián)物單克降抗體工作液的制備：采用鄰苯二甲酸二丁 酯人工抗原免疫鼠所得到，該抗體工作液用抗體稀釋液稀釋成1 :16000。
[0024] 所述鄰苯二甲酸二丁酯酶標二抗工作液的制備：用酶標二抗稀釋液稀釋成1 : 33000。所述底物液A為含有0. 5mmol/L的過氧化氫脲的檸檬酸一磷酸氫二鈉緩沖溶液；所 述底物液B為四甲基聯(lián)苯二胺的乙醇溶液；所述終止液為2mol/L的硫酸；所述濃縮洗滌液 是10倍濃縮洗滌液，其包含0. 5%吐溫-20,0. 01 mol/L的PBST，pH值范圍為7. 0-7. 5之 間。
[0025] 基于上述制備的試劑，本發(fā)明用于檢測鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA試劑盒包括如 下利料： (1) 96孔酶標板X 1塊（包被有偶聯(lián)抗原）； ⑵標準液 X6瓶：（lmL / 瓶）0 ng /mL、0. 5ng/mL、lng/mL、l. 5ng/mL、2ng/ml、2. 5ng/ mL ； (3) 酶標二抗工作液12 mL ; (4) 抗體上作液 7 mL : (5) 底物液A 7 ml,； (6) 底物液B 7 mL； (7) 終止液 7 ml，； (8) 10X濃縮洗滌液40 mL ; 使用本試劑盒時的注意事項： (1) 室溫低于20°C或試劑及樣本沒有回到室溫（20~25°C )會導致所有標準的0D值 偏低； (2) 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好 的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行一步操作； (3) 每加一種試劑前需將其搖勻； (4) 反應終止液為2M鹽酸，避免接觸皮膚； (5) 不要使用過了有效日期的試劑盒；也不要使用過了有效期的試劑盒中的任何試 劑，摻雜使用過了有效期的試劑盒會引起靈敏度的降低；不要交換使用不同批號試劑盒中 的試劑； (6) 儲存條件：保存試劑盒于2~8°C，不要冷凍，將不用的酶標板微孔板放進自封袋重 新密封。標準物質和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此耍避免苴接暴露存光線下； (7) 試劑變質的跡象：發(fā)色試劑有任何顏色表明發(fā)色劑變質，應當棄之。0標準的吸光 度（450 / 630 nm)值小于0. 5(A45()nm〈0. 5)時，表示試劑可能變質，請勿使用； (8) 該試劑盒最佳反應溫度為25°C，溫度過高或過低將導致檢測吸光度值和靈敏度發(fā) 生變化。
[0026] 本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯的ELISA試劑盒用于檢測塑料袋裝奶粉中殘留量時通 過以下步驟實施：樣品預處理、用本發(fā)明試劑盒進行檢測、分析結果。
[0027] (1)樣品預處理 稱取奶粉50g放入具塞三角瓶中，加入150mL的正己烷，充分混勻；20°C水浴超聲 萃取lh，浸泡過夜。提取液經(jīng)無水硫酸鈉過濾，氮吹濃縮至1 mL ;將SimonAldrichTM C8(3mL/200mg)固相萃取柱依次用5mL二氯甲烷、5mL甲醇、5mL純凈水淋洗進行活化，將待 凈化液過柱，流速小于1 mL/min;E.以5倍體積洗脫緩沖液洗脫，收集待用。
[0028] (2)用本發(fā)明試劑盒進行檢測上述樣品中鄰苯二甲酸二丁酯殘留量。
[0029] (3)取包被有鄰苯二甲酸二丁酯抗原的酶標板，加標準品/樣本50uL/孔到對應的 微孔中，加入鄰苯二甲酸二丁酯抗體工作液，50uL/孔，反應30 min。
[0030] (4再加入鄰苯二甲酸二丁酯酶標二抗工作液，100u L/孔，輕輕振蕩混勻，用蓋板 膜蓋板后置室溫25°C避光環(huán)境中反應30min。
[0031] (5)小心揭開蓋板膜，將孔內液體甩干，用洗滌工作液260 u L/孔，充分洗滌4-5 次，每次間隔10 s，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡用未使用過的槍頭戳破）。
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