一種丹參多酚酸提取物指紋圖譜及有關(guān)成分的含量測定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明涉及一種中藥提取物的檢測方法，特別涉及一種丹參多酚酸提取物指紋圖 譜的建立及有關(guān)成分的含量測定方法
【背景技術(shù)】：
[0002] 丹參為唇形科鼠尾草屬植物。又名：紫丹參、紅根、血參、大紅袍等。丹參以根供藥 用，味苦，性微寒。具有活血調(diào)經(jīng)、祛瘀生新、鎮(zhèn)靜安神、涼血消癰、消腫止痛等功能。用于治 療月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)、產(chǎn)后瘀阻腹痛、關(guān)節(jié)酸痛、神經(jīng)衰弱失眠、心悸、癰腫瘡毒等癥。近代醫(yī)學(xué) 臨床證明，丹參有擴張血管與增進冠狀動脈血流量的作用，用來治療冠心病、心絞痛、心肌 梗塞、心動過速等癥，有顯著的療效；還用來治療慢性肝炎、早期肝硬變等癥，亦有良好的效 果。
[0003] 丹參中含有兩類主要有效成分，即脂溶性丹參酮類和水溶性丹參酚酸類。現(xiàn)代醫(yī) 學(xué)認(rèn)為，丹參酸酸類（salvianolie acids)成分，能夠縮小心肌梗死的范圍，減輕其病情，對 大鼠心肌缺血、再灌注損傷具有保護作用，同時有明顯的抑制血小板聚集、抗凝、溶纖及降 低血脂、抗動脈粥樣硬化的作用，具有較大的臨床藥用價值。該類化合物主要有丹酚酸、丹 參素、原兒茶醛、咖啡酸等，其中丹酚酸B是丹參水溶性成分中的主要藥效成分。
[0004] 丹參多酚酸注射劑是一種已經(jīng)上市的產(chǎn)品，其活性物質(zhì)被稱為"丹參多酚酸"。丹 參多酚酸的提取制備方法有多種，例如：取丹參飲片，用純化水煎煮提取三次，每次〇. 5~ 1小時，將三次提取液合并，冷卻，用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至酸性，放置4~8小時，過濾，得澄明藥 液，將藥液用聚酰胺柱層析工藝純化，上樣后用純化水沖洗，以碳酸氫鈉溶液進行洗脫，收 集洗脫液，將洗脫液用鹽酸溶液調(diào)節(jié)至酸性，采用大孔樹脂柱層析工藝純化藥液，上樣后用 純化水沖洗，以乙醇溶液進行洗脫，收集洗脫液，將洗脫液減壓濃縮回收乙醇，所得濃縮液 冷藏12~24小時后過濾，濾液用氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH值至5. 3~6. 0,冷凍干燥，即得。 之后再將丹參多酚酸提取物與輔料進行混合制備成各種制劑。例如，與甘露醇溶液進行混 合，并調(diào)pH至5. 5~6. 0,定容后冷凍干燥，制備丹參多酚酸注射劑。
[0005] 作為丹參多酚酸注射劑的活性成分，目前丹參多酚酸提取物和制劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)現(xiàn) 狀來看，質(zhì)控項目很不全面，普遍采用紫外-可見分光光度法來測定多酚酸的含量。該法是 以丹酚酸B為對照計算多酚酸的含量，專屬性和準(zhǔn)確度差。且對于成分復(fù)雜的中藥制劑，僅 以一種成分控制含量指標(biāo)，在缺乏整體性的同時，對于復(fù)雜成分的指認(rèn)也并不充足。
[0006] 因此，針對上述復(fù)雜成分指認(rèn)不充分以及定量不準(zhǔn)確等缺陷。本發(fā)明開發(fā)了 UPLC 色譜指紋圖譜的方法，利用液質(zhì)進行峰指認(rèn)，從而確定了 23個紫外檢測共有的指紋峰。并 且同時對于指認(rèn)出的三個含量較大、活性比較明顯且結(jié)構(gòu)明確的指標(biāo)性成分建立了 HPLC 含量測定方法。
[0007] 本發(fā)明是以全面表征中藥制劑的質(zhì)量為目標(biāo)，提供了一種采用UPLC-PDA法（超高 效液相多波長可見紫外檢測法），建立了丹參多酚酸提取物的數(shù)字化定量指紋圖譜，并以二 級系統(tǒng)指紋定量法鑒定了多批丹參多酚酸提取物樣品的一致性與穩(wěn)定性，共檢出化學(xué)成分 39個，結(jié)合多級質(zhì)譜信息及對照品，鑒定丹參酚酸類化合物23個?？紤]到UPLC應(yīng)用到大規(guī) 模檢測的成本及HPLC的廣泛應(yīng)用性，又以HPLC-VWD法（高效液相色譜可變波長檢測法） 同時測定三個指標(biāo)性成分迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B的含量。在確保準(zhǔn)確性、有效性的同 時，又兼顧了成本節(jié)約原則，更適合應(yīng)用于擴大化生產(chǎn)，完善了現(xiàn)有的注射用丹參多酚酸的 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

【發(fā)明內(nèi)容】
：
[0008] 本發(fā)明提供一種丹參多酚酸提取物指紋圖譜及含量測定方法，其特征在于，步驟 如下：
[0009] 步驟1 :采用超高效液相多波長可見紫外檢測法，建立丹參多酚酸提取物數(shù)字化 定量指紋圖譜；
[0010] 步驟2 :利用質(zhì)譜對步驟1中指紋圖譜中的峰進行指認(rèn)，確定紫外檢測共有的指紋 峰；
[0011] 步驟3 :采用高效液相色譜可變波長檢測法對步驟2中指認(rèn)出的三個含量較大、活 性比較明顯且結(jié)構(gòu)明確的指標(biāo)性成分含量進行測定。
[0012] 進一步的，步驟1的具體步驟如下：
[0013] (1)對照品溶液的制備：精密稱定對照品丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚酸D、丹酚酸A、 丹酚酸-LM、迷迭香酸、紫草酸、丹酚酸B，加超純水溶解，定容至丹參素鈉、原兒茶醛、丹酚 酸D、丹酚酸A、丹酚酸-LM終濃度分別為200-500 μ g/ml，迷迭香酸、紫草酸終濃度分別為 300-600 μ g/ml，丹酚酸 B 終濃度為 500-1500 μ g/ml 即得；
[0014] (2)供試品溶液的制備：分別精密稱定10-50批丹參多酚酸提取物，樣品溶于超純 水，溶解后過濾膜，稀釋成濃度為lmg/mL-5mg/mL的溶液；
[0015] (3)指紋圖譜的測定：精密吸取供試品溶液1-5 μ L，注入超高效液相色譜儀，記錄 色譜圖，即得；
[0016] 其中，色譜條件如下：
[0017] 色譜柱：UPLC C18柱或Τ3柱；
[0018] 流動相：溶劑A冰，含〇. 1% -0.5%甲酸；溶劑B :乙腈，含1% -5%甲醇；
[0019] 梯度洗脫：
[0020] 0-3min, 12-18 % B ；3-15min, 18 % B ；15-17min, 18-20 % B ；17-25min, 20 % B ； 25-28min, 20-23 % B ；28-35min, 23 % B ；35-40min, 23-40 % B ；4〇-45min, 40-95 % B ； 45-50min, 95% B ；
[0021] 溫度：30-40°C;
[0022] 流速：0· 2-0. 3ml/min ;
[0023] 色譜圖光譜采集范圍：190~400nm。
[0024] 優(yōu)選的，步驟1中，
[0025] 色譜柱優(yōu)選：UPLC C18柱；
[0026] 流動相優(yōu)選：
[0027] 溶劑A冰，含0.2%甲酸；溶劑B:乙腈，含3%甲醇；或
[0028] 溶劑A :水，含0. 1 %甲酸；溶劑B :乙腈，含2%甲醇。
[0029] 本發(fā)明的UPLC的色譜條件是經(jīng)過篩選獲得的：
[0030] 1、色譜柱的選擇
[0031] 本發(fā)明對比了目前廣泛使用的三種不同廠牌色譜柱：(A)Fortis C1S1. 7μ m，2. lx 50mm ;(B) Agilent Eclipse Plus C18,1.8 μ m, 2. lx 150mm ;(C) Waters HSS T3C18,1.7 μ m, 2. lx 150mm。從三種柱子的液相對比譜圖中可以看出，待分析成分在A型色譜柱上出峰時 間較晚，且分離效果不好，考慮到擴大生產(chǎn)的成本及最終成分指認(rèn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，排除色譜 柱A ;而后對比丹參多酚酸樣品在色譜柱B及色譜柱C中的圖譜，可以明顯看到色譜柱B較 C分離效果更好，且B圖中的色譜峰數(shù)明顯多于C圖，有利于成分研究的全面性。后經(jīng)反復(fù) 實驗，發(fā)現(xiàn)Eclipse對于極性較大的酚酸類成分分離效果比較好，因此本發(fā)明優(yōu)化選用了 Eclipse Plus C18色譜柱。色譜圖見圖1。
[0032] 2、洗脫梯度的篩選：
[0033] (1)采用溶劑A冰，含〇. 1 %甲酸，溶劑B :乙腈，進行系統(tǒng)優(yōu)化，結(jié)果顯示極性較 大的色譜與鄰近雜質(zhì)難以分離。記錄如下：
[0034] (A)0-3min:12-20 % B, 3-10min:20-22 % B, l〇-22min:22 % B, 22-27min:22-35 % B, 27-29min:35% -50% B ；
[0035] (B) 0-3min:12-18 % B, 3-10min:18-22 % B, l〇-12min:22 % B, 12-22min, 22-25 % B ；22-27min:25-35% B, 27-29min:35% -50% B ；
[0036] (C) 0-2min: 12-18 % B, 2-5min: 18-22 % B, 5-15min: 22-25 % B, 15-20min: 25-45 % B, 20-25min:45% -95% B.
[0037] 色譜圖見圖2。
[0038] (2)將流動相優(yōu)化為溶劑A冰，含〇. 2%甲酸，溶劑B :乙腈，含2%甲醇，對分離細(xì) 節(jié)改善明顯，5-10分鐘得到分離。進一步優(yōu)化，高極性酚酸在18%有機相等度洗脫中得到 分離（圖3,13min)。記錄如下：
[0039] (A) 0-3min: 12-18 % B, 3-10min: 18-20 % B, l〇-20min: 20 % B ；
[0040] (B) 0-3min: 12-17 % B, 3-20min: 17 % B, 2〇-23min: 17-20 % B ；
[0041] (C) 0-3min: 12-18 % B, 3-15min: 18 % B, 15-17min: 18-20 % B, 17-25min: 20 % B.
[0042] 色譜圖見圖3、圖4(圖3放大圖）。
[0043] 3、方法學(xué)考察
[0044] (1)精密度試驗
[0045] 取供試品溶液（批號20130202)，連續(xù)進樣6次，以紫草酸為參照，分別對共有峰相 對保留時間和相對峰面積進行考察。各共有峰相對保留時間的RSD均小于0. 5%，相對峰面 積的RSD均小于3. 0%，表明儀器精密度良好。
[0046] (2)重復(fù)性實驗
[0047] 取樣品（批號20130202) 6份，按上述步驟1中方法制備供試品溶液，并進行檢測， 以紫草酸為參照分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察。各共有峰相對保留 時間的RSD均小于0. 5%，相對峰面積的RSD均小于3. 5%，表明本方法重復(fù)性良好。
[0048] (3)穩(wěn)定性試驗
[0049] 取供試品溶液（批號為130301)，分別于0, 2,4,8,12, 24h進樣分析，以紫草酸為參 照，分別對共有峰的相對保留時間和相對峰面積進行考察。
[0050] 結(jié)果表明，各共有峰相對保留時間的RSD均小于0. 5%，相對峰面積的RSD均小于 3.0%。表明供試品溶液在室溫24h內(nèi)穩(wěn)定。
[0051] 丹參多酚酸提取物樣品UPLC色譜圖（280nm)參見圖5。
[0052] 利用本發(fā)明步驟1的方法可對多批丹參多酚酸提取物樣品進行UPLC指紋圖譜分 析，并對各樣品的23個共有峰紫外光譜進行對比分析，從而對多批丹參多酚酸提取物樣品 的一致性與穩(wěn)定性進行鑒定。
[0053] 對于不同批次指紋圖譜相似度的對比分析，可采用市面上售賣的多種軟件進行。
[0054] 本發(fā)明優(yōu)選采用"中藥色譜指紋圖譜超信息特征數(shù)字化評價系統(tǒng)4. 0"軟件對結(jié)果 信號進行二級定量指紋圖譜分析，確定了對照指紋圖譜，并以此為參照計算各批次指紋圖 譜的相似度，得到多批樣品的最終指紋圖譜質(zhì)量結(jié)果。
[0055] 系統(tǒng)指紋定量法客觀、準(zhǔn)確地定量描述各化學(xué)物質(zhì)對復(fù)方制劑化學(xué)指紋的貢獻(xiàn)大 小。把丹參多酚酸提取物UPLC指紋看作一個整體，用宏定性相似度（