一種甘膽酸的測定試劑及其制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種甘膽酸的測定試劑及其制備方法，屬于生化手段測試技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 血清甘膽酸(CholyglyCine，CG)是膽酸與甘氨酸結(jié)合而成的結(jié)合型膽酸之一，在 肝細(xì)胞內(nèi)，膽固醇經(jīng)過極其復(fù)雜的酶促反應(yīng)，轉(zhuǎn)變成初級膽汁酸。其中有膽酸(CA)和鵝去氧 膽酸(CD-CA)。膽酸的類固醇核上有三個羥基(03、07、(：12)，側(cè)鏈末端的羥基以肽鍵與甘氨 酸結(jié)合，分子量為462u。
[0003] CG在肝細(xì)胞合成，經(jīng)膽管排入膽囊貯存，餐后膽囊收縮，隨同膽汁排入小腸，參與 脂肪的消化吸收，95 %的膽酸由小腸粘膜重吸收入血，經(jīng)門靜脈輸送至肝臟由肝細(xì)胞攝取。 正常情況下，肝臟能有效攝取門靜脈血中99%以上的CG重新泌入膽汁，僅有1%CG溢入體循 環(huán)。當(dāng)肝細(xì)胞受損時，肝細(xì)胞不能有效攝取經(jīng)腸肝循環(huán)達(dá)肝臟的CG，致使血中CG含量增高； 膽汁淤滯時，肝臟排泄膽酸發(fā)生障礙而返流入血循環(huán)中，也可使血中CG含量增高。
[0004] 臨床證明：肝損傷的生化指標(biāo)中CG比谷丙轉(zhuǎn)氨酶、膽紅素等試驗更敏感，具體如 下：
[0005] (1)在急性肝炎、慢性活動性肝炎、原發(fā)性肝癌、肝硬化及慢性迀延性肝炎等病癥 中，其血清CG的水平均高于正常對照組，升高陽性率按上述順序遞減，尤其在臨床鑒別慢性 活動性肝炎和慢性迀延性肝炎方面，慢活肝CG升高的幅度和頻率均高于慢迀肝，CG可作為 一項有價值的指標(biāo)，對判斷慢性活動性肝炎的進(jìn)展和緩解，預(yù)測療效和復(fù)發(fā)均有很好價值。 [0006] (2)血清甘膽酸含量升高程度與肝硬化的病理發(fā)展進(jìn)程呈正相關(guān)，是臨床判斷肝 硬化程度和預(yù)后的很好的指標(biāo)。
[0007] (3)血清甘膽酸水平在膽結(jié)石患者顯著升高，可高達(dá)50倍。
[0008] (4)梗阻性肝病時，CG水平增高10-20倍，藥物性膽汁郁積癥血清膽酸也增高。
[0009] (5)孕婦在懷孕的中后期，由于嬰兒的增大，會壓迫肝臟，使肝臟排泄膽酸發(fā)生障 礙而導(dǎo)致CG的偏高，嚴(yán)重者可能會導(dǎo)致死胎。
[0010] (6)妊娠期肝內(nèi)膽汁齡積癥（Intrahepatic cholestasis of pregnancy, ICP)又 稱妊娠遲發(fā)性膽汁淤積，屬高危妊娠之一。本病雖然無孕婦死亡，但對胎兒有嚴(yán)重影響，易 發(fā)生早產(chǎn)，胎兒宮內(nèi)窘迫甚至圍產(chǎn)兒死亡。
[0011] 目前國內(nèi)測定甘膽酸的方法主要有：
[0012] (1)乳膠增強(qiáng)免疫比濁法，該方法靈敏度較低，易出現(xiàn)前帶現(xiàn)象。
[0013] (2)化學(xué)發(fā)光法，該方法雖然靈敏度高，但不穩(wěn)定，重復(fù)性較差。
[0014] (3)酶聯(lián)免疫法，該方法定量準(zhǔn)確性差，操作時間長，自動化程度低，一般只用于定 性檢測。
[0015] 基于此，做出本申請。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0016] 為了克服現(xiàn)有甘膽酸在測試過程中存在的上述缺陷，本發(fā)明首先提供一種快速靈 敏、準(zhǔn)確性好、特異性高、穩(wěn)定性好、操作簡便，適用于臨床全自動或半自動生化分析的甘膽 酸測定試劑。
[0017] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案如下：
[0018] 一種甘膽酸測定試劑，包括R1試劑、R2試劑和甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣，所述的R1試劑是由硫 代氧化型輔酶I溶解于添加有緩沖液的純化水中所形成的溶液;所述的R2試劑是由還原型 輔酶I溶解于添加有緩沖液、甘膽酸脫氫酶、疊氮鈉的純化水中所形成的溶液;所述的甘膽 酸標(biāo)準(zhǔn)樣是由甘膽酸鈉水合物、緩沖液和疊氮鈉溶解于純化水中形成的溶液。
[0019] 進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：
[0020] 所述的緩沖液為磷酸鹽緩沖液或三羥甲基氨基甲烷，更優(yōu)選的，所述的磷酸鹽緩 沖液的pH為7.0，濃度為0.65mol/L。
[0021] 所述的硫代氧化型輔酶I為β-硫代煙酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型（Thio-NAD)，其 濃度為lg/L。
[0022] 所述的還原型輔酶I為β-煙酰胺脲嘌呤二核苷酸還原型(NADH)，其濃度為6g/L。
[0023] 所述的甘膽酸脫氫酶濃度2 5000U/L。
[0024] 所述的疊氮鈉濃度為0.6mol/L。
[0025] 同時，本發(fā)明還提供了一種具有上述特征甘膽酸測定試劑的制備方法，包括如下 步驟：
[0026] (1)R1試劑配制：向純化水中加入緩沖液，攪拌至完全溶解;加入硫代氧化型輔酶I 攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容；
[0027] (2)R2試劑配制：向純化水中加入緩沖液，攪拌至完全溶解;加入甘膽酸脫氫酶，攪 拌至溶解;添加疊氮鈉攪拌至溶解，加入還原型輔酶I攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容；
[0028] (3)甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣配制：向純化水中加入甘膽酸鈉水合物，攪拌至完全溶解;加入 緩沖液攪拌至溶解，加入疊氮鈉攪拌至完全溶解，繼續(xù)攪拌后定容；
[0029] (4)對上述制備的R1試劑、R2試劑及甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣進(jìn)行靈敏度、線性范圍、精密度 和準(zhǔn)確度進(jìn)行測定。
[0030]進(jìn)一步的，作為優(yōu)選：
[0031 ]所述的攪拌速度為450轉(zhuǎn)/分。
[0032] 步驟(1)中，所述的純化水為1500ml，定容體積為1600ml。
[0033] 步驟(2)中，所述的純化水為300ml，定容體積為400ml。
[0034] 步驟(3)中，所述的純化水為80ml，定容體積為100ml。
[0035] 本發(fā)明的工作原理如下：
[0036] 甘膽酸標(biāo)準(zhǔn)樣中的甘膽酸被甘膽酸脫氫酶(GCDH)及β-硫代煙酰胺脲嘌呤二核苷 酸氧化型（Thio-NAD)特異性地氧化，生成類固醇以及β-硫代煙酰胺脲嘌呤二核苷酸還原 Thio-NADH;而生成的類固醇在GCDH和β-煙酰胺脲嘌呤二核苷酸還原型(NADH)作用下，又生 成甘膽酸及β-煙酰胺脲嘌呤二核苷酸氧化型(NAD)。通過上述的循環(huán)，血清中微量的膽汁酸 量得到了放大，Thio-NADH也同比的擴(kuò)增，于是通過測定Thio-NADH在405nm特異性的吸光度 變化，即可計算得到標(biāo)本中甘膽酸的含量。
[0037] 上述工作原理中，其反應(yīng)過程具體如下：
[0040] (1)靈敏度評價試驗
[0041 ]根據(jù)GB/T26124-2011《臨床化學(xué)體外診斷試劑(盒)》中對"分析靈敏度"檢測的要 求，以試劑盒在規(guī)定參數(shù)下對分析靈敏度評價用樣本進(jìn)行檢測產(chǎn)生的吸光度改變，換算為η 單位的吸光度的差值（A Α)作為分析靈敏度。分析靈敏度評價試驗對分析靈敏度評價用樣 本重復(fù)測定20次。評估結(jié)果：分析靈敏度2.7mg//L吸光度變化率（Δ A/min) 2 0.00405ABS/ min〇
[0042] (2)線性范圍評價試驗
[0043]根據(jù)GB/T26124-2011《臨床化學(xué)體外診斷試劑(盒)》和《體外診斷試劑分析性能評 估指導(dǎo)原則一一線性范圍（征求意見稿)》中的建議，對試劑線性范圍進(jìn)行驗證時，在待驗證 線性范圍內(nèi)選擇5個濃度水平，每個濃度水平重復(fù)測定3次。
[0044] (3)精密度評價試驗
[0045]精密度評價包括重復(fù)性和批間差，且至少評估二個濃度水平樣本的精密度，其中 有一個濃度在醫(yī)學(xué)決定水平左右。因此，重復(fù)性評價采用在重復(fù)性條件下，用二個濃度水平 的控制物質(zhì)（其中一個濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平)測試，每個濃度重復(fù)測試10次;批間差評價 采用二個濃度水平的控制物質(zhì)(其中一個濃度接近醫(yī)學(xué)決定水平)分別測試3個不同批號的 試劑盒，每個批號測試3次。
[0046] (4)準(zhǔn)確度評價試驗
[0047]用不少于40個在檢測濃度范圍內(nèi)的不同濃度的人源樣品，以指定的分析系統(tǒng)作為 比對方法，每份樣品按待測試劑操作方法及比對方法分別檢測。用線性回歸方法計算兩組 結(jié)果的相關(guān)系數(shù)(r)及每個濃度點的相對偏差。
[0048]評估結(jié)果:三批試劑的重復(fù)性變異系數(shù)CV < 6% ;批間差< 10% ;相對偏差< 15%， 試劑線性可達(dá)80mg/L，分析靈敏度2.7mg/L吸光度變化率（ΔΑ/min) 2 0.00405ABS/min。
[0049] 本發(fā)明利用酶循環(huán)法測定甘膽酸的方法，其優(yōu)點是快速靈敏，準(zhǔn)確性好，特異性 高，穩(wěn)定性好，操作簡便，可適用于臨床全自動或半自動生化分析儀配套使用。
【具體實施方式】
[0050] 本實施例所用主要試劑:磷酸鹽緩沖液:PH7.0，0.65mmol/L; Thio-NAD(硫代氧化 型輔酶I): lg/L;甘膽酸脫氫酶(GCDH): 2 5000U/L:疊氮鈉:0 · 6mmol/L;NADH(還原型輔酶 I) :6g/L;均購自Enzymaker公司。
[0051 ] 1)R1試劑的配制
[0052] ①將1500ml純化水加入到適當(dāng)容器中。
[0053] ②開啟電動攪拌器，攪拌速度均為450轉(zhuǎn)/分。
[0054] ③稱取Tris lg加入上述純化水中，攪拌至完全溶解。
[0055] ④稱取lg硫代氧化型輔酶I加入上述溶液中，攪拌至完全溶解。