用于測定包含可溶性Fcγ受體的組合物的穩(wěn)定性的體外方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明實質(zhì)上涉及一種用于測定組合物的穩(wěn)定性的體外方法，所述組合物包含可 溶性人Fc γ受體ΙΙΑ、ΙΙΒ、ΙΙΙΑ和/或ΙΙΙΒ或?qū)嵸|(zhì)上由可溶性人Fc γ受體ΙΙΑ、ΙΙΒ、ΙΙΙΑ和/ 或IIIB組成，所述方法包括以下步驟:使包含人Fc γ受體ΙΙΑ、ΙΙΒ、IIΙΑ和/或IIIB的表面與 設(shè)置量的聚集人IgG接觸;使包含人Fc γ受體IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的所述表面與設(shè)置量 的所述可溶性人Fc γ受體IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的組合物接觸；測定結(jié)合至包含所述人 Fey受體ΙΙΑ、ΙΙΒ、ΙΙΙΑ和/或ΙΙΙΒ的所述表面的聚集人IgG的量，和將如在步驟(c)中測得 的結(jié)合至所述表面的聚集人IgG的量與參考值比較，并且（由此)測定所述包含可溶性人Fc γ受體ΠΑ、ΠΒ、ΙΙΙΑ和/或IIIB或?qū)嵸|(zhì)上由可溶性人Fey受體IIA、IIB、IIIA和/或IIIB組 成的組合物的穩(wěn)定性。本發(fā)明還涉及可通過如本文限定的方法獲得的聚集人IgG，以及在本 發(fā)明的方法中提到的聚集人IgG的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] Fc受體(FeR)在免疫系統(tǒng)中具有重要作用，在免疫系統(tǒng)中它們控制免疫應(yīng)答的程 度和強度。在病原體進入血液循環(huán)后，它們被免疫球蛋白（Ig)調(diào)理。產(chǎn)生的免疫復(fù)合物(1C) 由于它們的多價性以高親合力結(jié)合至帶有FeR的細胞，從而導(dǎo)致FeR的簇集，所述簇集觸發(fā) 若干效應(yīng)功能(Metzger，H.，J. Immunol · 1992,149:1477-1487)。取決于表達的FeR類型及相 關(guān)蛋白，所述效應(yīng)功能包括后續(xù)為病原體中和和抗原遞呈的內(nèi)吞、抗體依賴性的細胞毒性 (ADCC)、介質(zhì)分泌或抗體產(chǎn)生的調(diào)節(jié)(Fridman等人，Immunol Rev. 1992，125:49-76; van de Winkel和Capel，Immunol.Today 1993,14:215-221)〇
[0003] 免疫復(fù)合物作為適應(yīng)性免疫的一部分源自抗體、抗原、補體和各種受體之間的復(fù) 雜的相互作用。在免疫復(fù)合物中結(jié)合至抗體的抗原一般會被多種細胞機制清除，所述細胞 機制在生理上甚至能夠消除少量的來自循環(huán)的"外源抗原"。免疫復(fù)合物能夠在人暴露于外 源物質(zhì)如蛋白質(zhì)(感染、疫苗、藥物等)或者需要蛋白質(zhì)載體來激活級聯(lián)反應(yīng)的非蛋白物質(zhì) (半抗原）時形成。當(dāng)（致病的）免疫復(fù)合物病理性沉積于不同器官時形成自身免疫性障礙， 從而引發(fā)導(dǎo)致器官損傷/疾病的炎癥性級聯(lián)反應(yīng)。當(dāng)調(diào)節(jié)障礙在一個或多個這些部件中發(fā) 生時，免疫復(fù)合物疾病能夠以各種各樣的方式出現(xiàn)。
[0004] 特異性Fey R存在于所有免疫球蛋白（Ig)類別中。由于IgG是在人體循環(huán)中發(fā)現(xiàn)的 豐度最大的抗體同種型，可見對于IgG的FeR，F(xiàn)c γ受體(Fc γ R)，是豐度最大的并具有廣泛 的多樣性。在其它哺乳動物物種中發(fā)現(xiàn)了與人FeyR相對應(yīng)的正源蛋白質(zhì)，所述其它哺乳動 物物種包括其它靈長類動物例如猴子和小鼠。如同人，其它物種也擁有若干種與其相應(yīng)IgG 亞類有不同親和力的Fc γ LFc γ R包含激活性和抑制性受體二者，這種陽性和陰性信號的 整合對于高效的免疫應(yīng)答是必要的。
[0005] 人中存在三種類型的Fc γ R:高親和力受體Fc γ RI和低親和力受體Fc γ RII與Fc γ RIILFc γ RI(CD64)、Fc γ RII(CD32)和Fc γ RIIIA(CD16)作為I型跨膜蛋白或者以可溶形式 (sFc γ R)存在，但是還存在Fc γ RIII(Fc γ RIIIB)的糖基化磷脂酰肌醇錨定形式。此外，F(xiàn)c yR 以多種同工型（Fc yRIA、Bl、B2、C;Fc yRIIAl-2、Bl-3、C)和等位基因（卩。丫1?1131-冊、-LR;FcyRIIIb-NAl、-NA2)(van de Winkel和Capel，Immunol.Today 1993,14:215-221)存 在。如上所述，這些Fey R對于IgG具有不同的親和力，尤其對于不同IgG亞類具有不同的結(jié) 合親和力。人中存在4種IgG亞類，按照它們在血清中的豐度命名（IgGl(66%)、2(23%)、3 (7% )、和4(4% ) ;Hashira等人，Pediatr. Int. 1993,42(4): 337-221)。
[0006] Fc γ RII是免疫活性細胞上分布最為廣泛的受體，并與Fc γ RIIIA-起主要參與免 疫復(fù)合物內(nèi)吞作用。Fc γ RII存在三種同工型Fc γ RIIA、Fc γ RIIB和Fc γ RIIC，然而，F(xiàn)c γ RIIB和Fc γ RIIC的胞外區(qū)相同，而Fc γ RIIA在其胞外區(qū)中只有7%的氨基酸殘基不同。雖然 如此，兩種形式均能夠通過它們與人和小鼠 IgG亞類的結(jié)合特點（van de Winkel和Cape 1， Immunol · Today 1993，14:215-221)以及它們對于人IgGs不同的親和力(Bruhns等人，Blood 2009,113:3716-3725)被區(qū)分開。Fey RIIIA是誘導(dǎo)ADCC的關(guān)鍵受體，而抑制性Fey RIIB代 表唯一的FcR在B細胞上表達。就這一點上，F(xiàn)c γ RIIB的表達對于B細胞向下調(diào)節(jié)而導(dǎo)致抗體 產(chǎn)生減少是必不可少的。
[0007] 以sFcyRIIB為基礎(chǔ)，本發(fā)明人正在開發(fā)用于治療自身免疫性疾病的新型手段和 方法。最先進的產(chǎn)品是SM101，它與在免疫細胞上表達的Fc γ R競爭致病性免疫復(fù)合物的結(jié) 合。SM101目前正在參與美國和歐洲用于治療自身免疫性障礙例如紅斑狼瘡和免疫性血小 板減少癥的臨床試驗。
[0008] 假定蛋白質(zhì)性藥物，例如包含SM101的藥劑或藥物組合物，可能在儲存過程中降 解，因而特別想要開發(fā)可再現(xiàn)的體外測試，所述測試反映此類蛋白質(zhì)或包含此類蛋白質(zhì)的 組合物的剩余活力。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 因此本發(fā)明的技術(shù)問題是開發(fā)一種用于測定包含可溶性人Fc γ R的組合物的穩(wěn)定 性的體外方法。
[0010] 本發(fā)明的發(fā)明人觀察到從"正常"或"健康"人群獲得的人IgG制備物(例如市售靜 脈內(nèi)免疫球蛋白（IVIG)制備物)包含迄今為止未鑒定的聚集人IgG級分，該級分可以以標(biāo)準(zhǔn) 化且可靠的方式提供。這是讓人驚奇的，因為之前并不清楚這樣的致病性免疫復(fù)合物的類 似物能夠來源于其它"正常"或"健康"的人群。所述聚集人IgG結(jié)合至Fc γ R受體，由此模仿 體內(nèi)情形（即，其模仿前面提及的致病性免疫復(fù)合物)并因此可以被用于旨在檢測、測定或 驗證包含水溶性人Fc γ受體ΙΙΑ、ΙΙΒ、IIΙΑ和/或IIΙΒ的組合物的穩(wěn)定性的方法中。尤其是， 聚集人IgG是非熱聚集的，例如如Engelhard,等人，（1990)，Eur.J. Immunol .20,1367-1377、 Bruhns等人·（2009)，Blood J. 113(16) ,3716-3725或者US2008/008700中所描述的。Bruhns 等人描述了通過人IgG在pH 8.0和63°C下在硼酸鹽緩沖鹽水溶液中孵育30分鐘且不經(jīng)任何 后續(xù)處理產(chǎn)生的熱聚集人IgG(第3718頁，免疫球蛋白結(jié)合測定），以及源自與抗NIP mAb復(fù) 合的化學(xué)改性BSA(NIP12-BSA-生物素)的人工免疫復(fù)合物，所述抗NIP mAb從細胞培養(yǎng)上清 液純化獲得（第3717頁，抗體和試劑）。同樣地，US2008/008700在第8頁第[0093]段公開了 HAGG(熱聚集IgG)的用途。
[0011] 本發(fā)明因此涉及一種用于測定組合物、優(yōu)選藥物組合物（與藥劑等同）的穩(wěn)定性 (例如放置穩(wěn)定性或貯存穩(wěn)定性)的體外方法，所述組合物包含可溶性人Fc γ受體IIA、IIB、 IIΙΑ和/或IIIB或基本上由可溶性人Fc γ受體IIA、IIB、IIΙΑ和/或IIIB組成，所述方法包括 以下步驟：
[0012] (a)使包含人Fey受體IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的表面與設(shè)置量的聚集人IgG接 觸；
[0013] (b)使包含人Fey受體IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的所述表面與設(shè)置量的所述可溶 性人Fc γ受體IIA、IIB、IIIA和/或IIIB的組合物接觸;和
[0014] (c)測定結(jié)合至包含所述人Fey受體ΙΙΑ、ΙΙΒ、ΙΙΙΑ和/或ΙΙΙΒ的所述表面的聚集 人IgG的量，
[0015] (d)以及將如在步驟(c)中測得的結(jié)合至所述表面的聚集人IgG的量與參考值比 較，并且（由此)測定所述包含可溶性人Fc γ受體IIA、IIB、IIIA和/或IIIB或?qū)嵸|(zhì)上由可溶 性人Fc γ受體IIA、IIB、IIΙΑ和/或IIΙΒ組成的組合物的穩(wěn)定性，例如放置穩(wěn)定性、時間穩(wěn)定 性、保質(zhì)期。
[0016] 本發(fā)明方法中的步驟(a)和(b)能夠同時或相繼進行。還設(shè)想步驟(b)和(a)的順序 顛倒。
[0017] 設(shè)想本發(fā)明的方法包括洗滌步驟，該步驟在步驟(c)之前進行，優(yōu)選在步驟(a)和 (b)之后進行。
[0018] 優(yōu)選地，本發(fā)明上下文中采用的所述可溶性Fc γ受體為可溶性Fc γ IIB受體。特別 優(yōu)選地，所述可溶性人FcyllB受體為SM101(SEQ ID No.l)，包括經(jīng)由這些受體在宿主細胞 中表達而獲得的制備物，所述宿主細胞例如哺乳動物細胞或細菌細胞如大腸桿菌 (E.coli) 〇
[0019] 本發(fā)明同樣涉及本文定義的聚集人IgG在本發(fā)明的方法和實施方案中的用途。
[0020] 在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語"體外方法"指的是一種在人體或動物體外進行的方 法，與體內(nèi)方法相對。
[0021] 詞語"方法"可以被"測試"或"測定"或類似的詞語所替代。
[0022] 術(shù)語"穩(wěn)定性"包括"放置穩(wěn)定性"或"保質(zhì)期"或"半衰期"。組合物的"穩(wěn)定性"實質(zhì) 上涉及包含在其中的主要成分的穩(wěn)定性，即本文定義的可溶性人Fc γ受體IIA、IIB、IIIA 和/或ΙΙΙΒ的穩(wěn)定性。所述穩(wěn)定性可能會受到不同參數(shù)的影響，例如時間，8卩"時間穩(wěn)定性"； 溫度，緩沖條件，可溶性人Fc γ受體ΙΙΑ、ΙΙΒ、ΙΙΙΑ和/或ΙΙΙΒ的生產(chǎn)宿主;人Fc γ受體ΙΙΑ、 ΙΙΒ、ΙΙΙΑ和/或ΙΙΙΒ的序列；人Fey受體ΙΙΑ、ΙΙΒ、ΙΙΙΑ和/或ΙΙΙΒ的制造方法，等等。
[0023] 通過測定本發(fā)明（包含可溶性人Fc γ受體IIA、IIB、IIΙΑ和/或IIΙΒ或基本上由可 溶性人Fc γ受體IIA、IIB、IIΙΑ和/或IIΙΒ組成）的組合物的穩(wěn)定性，同樣可以監(jiān)測/控制所 述組合物（即實質(zhì)上所述組合物的主要成分，即可溶性人Fey受體ΙΙΑ、ΙΙΒ、ΙΙΙΑ和/或 ΙΙΙΒ)的質(zhì)量/條件/結(jié)合能力。
[0024] 在一個優(yōu)選的實施方案中，"組合物"是藥物組合物（與藥劑等同）或者診斷組合 物，可以另外包含藥學(xué)上或診斷學(xué)上可接受的載體、緩沖劑、成分等等。所述組合物還可以 進一步包含治療活性成分。
[0025] 術(shù)語"聚集人IgG"（有時也表示為"人聚集IgG"或類似的名字)指的是人IgG制備物 的聚集部分。這種制備物出人意料地存在于可以用于靜脈內(nèi)或皮下或肌肉給藥的基于血液 的產(chǎn)品（例如合并的人I gG制備物或IVIG)中，所述產(chǎn)品含有合并的(優(yōu)選多價的）I gG。因此， 聚集人IgG優(yōu)選可以從合并的人IgG制備物中獲得/分離，或是可從合并的人IgG制備物中獲 得的，所述合并的人IgG制備物例如IVIG制備物/組合物。設(shè)想所述聚集人IgG是可以從 蛋白"中分離的聚集人IgG，所述人蛋白以至少90%人IgG的含量為特征。所述人蛋白源自/ 可源自人血清或血漿，并且在一個優(yōu)選的實施方案中被表征為或被鑒定為是正常的人免疫 球蛋白（人IgG)，具有根據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)藥物統(tǒng)計方法整合中心(WHOCC)的解剖學(xué)、治 療學(xué)及化學(xué)(ATC)分類系統(tǒng)的ATC代碼J06BA01或者J06BA02。當(dāng)用于本文時，術(shù)語"人蛋白" 包括合并的人IgG制備物。在一個優(yōu)選的實施方案中，人IgG包含為亞型IgGl的至少50% IgG。在一個更優(yōu)選的實施方案中，人IgG(進一步)包含為亞型IgG2的至少20% IgG。在一個 特別優(yōu)選的實施方案中，所述聚集人IgG足從Beriglobin?、Varitcct?或Vcnbig?中，優(yōu) 選Beriglobin中獲得/分離的，或是可從Bcriglobin?、Varitect?或Vcnbig?十，優(yōu)選 86^ 81〇1^11中獲得的。86481〇1^11包含95%或者更多的、例如100%186。舉例而言，含有 100%186的864 81〇1^11能夠包含61%1861、28%1862、5%1863、6%1864，并可至多包含約 1 % IgA。為Beriglobin、Varitect和Vendig指示的百分值指的是％ (w/w)。示例性的 Beriglobin是批號為2