一種檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白特異性抗體的多肽-酶聯(lián)免疫吸附試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是用于檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白特異性抗體的多肽-酶聯(lián)免疫吸附試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒(severe fever with thrombocytopeniasyndrome virus，SFTSV)也稱新型布尼亞病毒，是布尼亞病毒科白齡病毒屬的一種新病毒，由蜱蟲叮咬傳播。該病臨床上表現(xiàn)為起熱急、乏力、惡心、嘔吐等胃腸消化道癥狀，并伴有血小板減少、白細胞減少，部分病例有頭痛甚至出血等癥狀，少數(shù)重癥患者因多器官衰竭而死亡，病死率約為10%。
[0003]發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒為單股負鏈RNA病毒，其基因組由大片段(L)、中片段(M)、小片段(S)三個基因片段組成。其中M片段全長為3378個核苷酸，含有單一的開放讀碼框架，編碼一個含1073個氨基酸的包膜蛋白前體，翻譯后經(jīng)宿主細胞內(nèi)蛋白酶的修飾產(chǎn)生兩個糖基化的包膜蛋白(Gn和Ge)，它們抗原性很強且均含有線性B細胞抗原決定簇位點，能夠誘導(dǎo)機體產(chǎn)生特異性抗體。線性B細胞抗原決定簇由連續(xù)的氨基酸序列組成，可以與由完整抗原誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體發(fā)生結(jié)合作用。因此可利用這些抗原表位來捕獲特異性抗體，實現(xiàn)抗體檢測。
[0004]目前針對發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒的檢測方法主要有核酸分子生物學(xué)檢測法和免疫學(xué)檢測法，如反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(RT-PCR)、中和試驗等。RT-PCR技術(shù)依賴精密儀器，對操作人員要求較高，實驗成本高，因此在大量樣品檢測中受到限制；中和試驗的實驗周期較長，靈敏度和特異性較差，在實際應(yīng)用過程中存在一定局限性。因此迫切需要建立快捷有效的對發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染情況進行評估的檢測試劑盒。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白特異性抗體的多肽-酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒，可用于檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒特異性抗體，評估發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染情況。用人工合成方法制備包含發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白優(yōu)勢線性B細胞抗原決定簇位點的多肽，純度高，特異性好，直接瞄準(zhǔn)相應(yīng)抗體，避免其他物質(zhì)引起的非特異性反應(yīng)，減少假陽性，提高檢測準(zhǔn)確性，具有靈敏度高，成本低，操作簡便，速度快、特異性強等優(yōu)點，能被基層單位廣泛使用。
[0006]本發(fā)明涉及一種檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白特異性抗體的多肽-酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒，包含包被發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白優(yōu)勢線性B細胞抗原多肽的酶標(biāo)板、樣品稀釋液、陰性對照血清、陽性對照血清、辣根過氧化物酶標(biāo)記的抗體、濃縮洗滌液、酶底物溶液和終止液。其主要技術(shù)方案如下:人工合成發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白Gn上的RGGRSQVSYYPAENSYSR、GKSRTES、REHKTKWVQESSS、SESEEKAC、VNPPEQR、SSGKKSTEIHFH、NGEGNQDDVR七段和Ge上的KCKKSSS、EELKSKK、SSEESARTIK、RFERSHDSQ、HSSKNST、QVFRSRTKLA六段包含優(yōu)勢線性B細胞抗原決定簇位點的多肽，用包被緩沖液將各多肽稀釋至10微克/毫升;每種多肽溶液各取I毫升，混勻后以100微升/孔的量包被于96孔酶標(biāo)板中，4°C反應(yīng)過夜后洗板3次;每孔加入200微升含有I %牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液進行封閉，37°C孵育I小時后洗板3次，晾干后備用。該板與待測樣品37°C孵育I小時，可以結(jié)合樣品中的特異性抗體。同時設(shè)立陰性對照孔、陽性對照孔和空白孔。洗滌3次后，加入稀釋5000倍的HRP酶標(biāo)抗體，每孔100微升，37°C孵育30分鐘后洗板3次，加入酶底物鄰苯二胺(oro)顯色，輕拍混勻后37°C孵育10分鐘。每孔加入終止液50微升，震蕩10秒混勻，用酶標(biāo)儀測定490納米的吸光度值。以P/N比值法判定結(jié)果，樣品吸光度值/陰性對照吸光度值2 2.1為陽性，小于2.1為陰性。
[0007]本發(fā)明提供的檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白特異性抗體的多肽-ELISA試劑盒，可用于檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒特異性抗體。
[0008]本發(fā)明提供的檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白特異性抗體的多肽-ELISA試劑盒，可用于評估發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒感染情況，應(yīng)用于血清學(xué)和流行病學(xué)研究等。
[0009]本發(fā)明檢測發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白特異性抗體的多肽-ELISA試劑盒的制備方法，工藝流程圖(見附圖1)，具體步驟如下:
[0010](I)根據(jù)線性B細胞抗原決定簇抗原性強、表面性好、親水性強的特點，使用生物信息學(xué)軟件分析發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒包膜糖蛋白(Gn和Ge)的氨基酸序列，預(yù)測并確定該病毒包膜糖蛋白上的優(yōu)勢線性B細胞抗原決定簇位點。
[0011](2)人工合成Gn的RGGRSQVSYYPAENSYSR、GKSRTES、REHKTKWVQESSS、SESEEKAC、VNPPEQR、SSGKKSTEIHFH、NGEGNQDDVR七段和Ge的KCKKSSS、EELKSKK、SSEESARTIK、RFERSHDSQ、HSSKNST、QVFRSRTKLA六段包含Gn、Gc優(yōu)勢線性B細胞抗原決定簇位點的多肽，并鑒定純度。
[0012](3)將合成出來的多肽作為抗原，用包被緩沖液分別稀釋到10微克/毫升，各取I毫升多肽溶液進行混合，混勻后以100微升/孔的量包被于96孔酶標(biāo)板中，4°C過夜后洗板3次。每孔加入200微升含有I %牛血清白蛋白的磷酸鹽緩沖液進行封閉，37°C孵育I小時后洗板3次，晾干，用密封袋封裝酶標(biāo)板，4 °C保存，即為預(yù)先包被好抗原的酶標(biāo)板。
[0013](4)本試劑盒中所含陰性對照血清為正常血清樣本，陽性對照血清為明確感染該病毒的患者血清樣本，并已通過實驗驗證。
[0014](5)本試劑盒涉及的其他試劑配制方法如下:
[0015]包被緩沖液(0.05摩爾/升碳酸鹽緩沖液，pH9.6):1000毫升蒸餾水中加入1.59克碳酸鈉(Na2CO3)和2.93克碳酸氫鈉(NaHCO3)，溶解混勻。
[0016]磷酸鹽緩沖液(0.01摩爾/升?83，？!1 7.4): 1000毫升蒸餾水中加入8.0克氯化鈉(NaCl ),0.2克磷酸二氫鉀(KH2PO4)，2.9克磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20)和0.2克氯化鉀(KCl)，溶解混勻。
[0017]封閉液:100毫升PBS洗液中加入I克牛血清白蛋白，溶解混勻。
[0018]樣品稀釋液:PBS中加入I %牛血清白蛋白及0.1 %吐溫-20，pH7.4。
[0019]酶標(biāo)抗體:HRP標(biāo)記的抗體，市售，用樣品稀釋液稀釋5000倍使用。
[0020]濃縮洗滌液:含有I %吐溫-20，pH7.4的100毫摩爾/^PBS，洗滌時稀釋10倍使用。
[0021]酶底物A溶液:5.1克檸檬酸(C6H8O7.H2O)，18.4克磷酸氫二鈉(Na2HPO4.12H20)，加水定容到1000毫升后混勾。
[0022]酶底物B溶液:30 %雙氧水(H2O2) I毫升。
[0023]酶底物C:鄰苯二胺((PD)粉末I克。
[0024]終止液:2摩爾/升的硫酸溶液，取108.7毫升98%濃硫酸加入891.3毫升中，混勻冷卻。
[0025](6)使用本發(fā)明試劑盒檢測樣本的具體方法如下:
[0026]取出試劑盒中已經(jīng)包被好發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒Gn、Gc蛋白線性B細胞抗原多肽的酶標(biāo)板。用樣品稀釋液將各樣品稀釋100倍，加入預(yù)先制備好的酶標(biāo)板孔中，每孔100微升，同時設(shè)立陰性對照孔、陽性對照孔和空白孔，37°C孵育I小時，洗滌液洗板3次。將酶標(biāo)抗體用樣品稀釋液稀釋5000倍，加入孔中，每孔100微升，37°C孵育30