一種基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒及使用方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒及使用方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 絲狀支原體山羊亞種Mmc是致山羊和綿羊發(fā)生慢性呼吸道傳染疾病及影響?zhàn)B羊業(yè) 發(fā)展的重要疫病的主要病原菌之一，所致傳染性胸膜肺炎潛伏期平均為18~20d，最短的是3 ~6d，最長可達(dá)到30~40d。其臨床癥狀表現(xiàn)主要為體溫升高、萎靡呆立、食欲減退、呼吸困難 且痛苦呻吟。帶菌羊和病羊是該病的主要傳染源，該病主要是在接觸傳播和呼吸道，病死率 較高(Engin Balikci，2008;田青，2006)。1971年Carmicheal分離到具有致病性新型支原 體，且命名為絲狀支原體山羊亞種，相繼在許多國家如敘利亞、印度、蘇丹和肯尼亞等地發(fā) 現(xiàn)該病原。我國于在內(nèi)蒙古曾經(jīng)流行該病(Carmichael L E，1972;鄒聯(lián)斌，2007)。絲狀支 原體山羊亞種引發(fā)的早期支原體肺炎病例長時間以來未曾引起人們的重視，但近年調(diào)查發(fā) 現(xiàn)，該病死亡率呈不斷上升趨勢，給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失(張雙翔，2013)。
[0003] 對絲狀支原體山羊亞種的防控，目前主要依靠藥物預(yù)防，也可使用疫苗，但防控成 本很高，究其原因與Mmc分離培養(yǎng)費(fèi)時費(fèi)力有關(guān)(候相山等，2006;趙萍等，2008)。臨床疫苗 應(yīng)用后，目前缺乏疫病檢測與防控所需的快速血清學(xué)檢測手段，尤其可高通量檢測、敏感性 高的ELISA方法，缺乏有效的免疫防控效果評估，給養(yǎng)羊業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失（張雙翔， 2012)。構(gòu)建含Mmc LppA蛋白C末端基因的原核表達(dá)載體，建立基于表達(dá)產(chǎn)物Mmc LppA蛋白 的間接ELISA技術(shù)十分必要和緊迫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于，選取核苷酸同源性較高的Mmc貴州分離株株，通 過Mmc LppA基因原核表達(dá)載體的構(gòu)建與表達(dá)，建立基于表達(dá)產(chǎn)物Mmc LppA蛋白的間接 ELI SA方法，并進(jìn)行條件優(yōu)化，制備成商品化間接ELI SA試劑盒。該間接ELI SA試劑盒的發(fā)明， 將為Mmc引起的山羊間質(zhì)性肺炎疫病的早期監(jiān)測、免疫效果評價提供關(guān)鍵技術(shù)，對本病原所 致疫病的早發(fā)現(xiàn)早防控具有重要意義。
[0005] 本發(fā)明的技術(shù)方案為： 一種基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒，間接ELISA試劑盒的原料配方為:包被酶 標(biāo)板卜5個，Mmc標(biāo)準(zhǔn)陽性血清0.5~1.5mL、Mmc標(biāo)準(zhǔn)陰性血清0.5~1.5mL、酶標(biāo)二抗300-500μ 1^、50\?831'緩沖液2〇-2511^、底物液41〇11^-1511^、底物液81〇11^-1511^和終止液1〇11^-1511^。
[0006] 包被酶標(biāo)板為重組蛋白包被，重組蛋白為Mmc LppA基因通過大腸桿菌Rosseta (DE3)表達(dá)系統(tǒng)獲得LppA重組蛋白，并通過鎳柱親和層析法獲得純化蛋白，使用包被緩沖液 稀釋為l.〇yg/l〇〇 yL ~3.0yg /100yL，室溫包被酶標(biāo)板12h，3g/100mL的BSA溶液，37°C封閉 ELISA反應(yīng)板1.5h后即為包被酶標(biāo)板。
[0007] Mmc標(biāo)準(zhǔn)陽性血清應(yīng)用絲狀支原體山羊亞種GZ-LD株免疫山羊獲得的高免血清，按 1:100稀釋。
[0008] Mmc標(biāo)準(zhǔn)陰性血清為采集自絲狀支原體山羊亞種血清抗體陰性的山羊血清，按1: 100稀釋。
[0009] 所述酶標(biāo)二抗為兔抗羊IgG-HRP，按1:2000稀釋使用。
[0010]所述50XPBST緩沖液為：NaCl 400.0 g、KCl 10.0 g、KH2P04 10.0 g、Na2HP04 · 12H20 145 g、Tween-20 25 mL溶于400~500 mL蒸餾水，調(diào)整pH為7.2~7.6,定容至 1000 mL〇
[0011]所述底物液A為Na2HP04 14.60 g、檸檬酸9.33 g、過氧化氫脲0.52 g，溶于三蒸 水，并定容至1000 mL，調(diào)至p Η 5.0~5.4。
[0012] 所述底物液Β為TMB 20mg、無水乙醇8~10 mL，加雙蒸水至1 000 mL，過濾除菌，無 菌分裝。
[0013] 所述終止液為0.2 %~0.3% HF溶液。
[0014] -種基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒的使用方法，包含以下步驟： 第一，取包被酶標(biāo)板，應(yīng)用TOST洗滌ELISA反應(yīng)板5次； 第二，將陰、陽性對照血清及待檢血清做1:100倍稀釋，按100yL加入酶標(biāo)板反應(yīng)孔中， 37°C孵育lh后，應(yīng)用PBS洗滌ELISA酶標(biāo)板各反應(yīng)孔5次； 第三，將兔抗羊I gG-HRP用PBST做1:2000倍稀釋，按1 OOyL加入酶標(biāo)板反應(yīng)孔，37 °C作用 lh后，應(yīng)用PBST洗滌酶標(biāo)板反應(yīng)孔5次； 第四，將底物液A和B各50yL加入ELISA反應(yīng)板，避光室溫顯色10~15min，加入50yL終止 液，立即在酶標(biāo)儀630nm波長下讀取0D值； 第五，試驗成立條件為陽性血清0D630平均值2 3.069，陰性血清0D630平均值< 1.741; 試驗結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)為待檢樣本0D630值2 2.738為陽性，待檢樣本0D630值<2.738為陰性。 [0015 ]本發(fā)明有益效果:本發(fā)明方法適用于檢測羊Mmc感染抗體和免疫抗體，能夠體現(xiàn)機(jī) 體內(nèi)Mmc感染水平或疫苗免疫效果，將為Mmc引起的山羊間質(zhì)性肺炎疫病的早期監(jiān)測、免疫 效果評價及后續(xù)研究工作提供關(guān)鍵技術(shù)，對本病原所致疫病的早發(fā)現(xiàn)早防控具有重要意 義，改變本病防控與監(jiān)測缺乏商品化ELISA試劑盒的局面。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以 下的技術(shù)優(yōu)勢和積極效果： (1)效果好:試劑盒能夠較好的體現(xiàn)機(jī)體Mmc感染水平或疫苗免疫水平;本試劑盒相對 于全菌蛋白包被，其敏感性、特異性更高，為Mmc引起的山羊和綿羊間質(zhì)性肺炎的早期監(jiān)測、 疫苗免疫效果評價具有重要意義。
[0016] (2)制備簡單、生產(chǎn)成本低:本試劑盒相對于全菌蛋白包被，解決了 Mmc培養(yǎng)困難、 培養(yǎng)周期長等問題，且保證了試劑盒批次間可重復(fù)性、一致性，重組蛋白的大批量生產(chǎn)、純 化成本低，周期短，提高了市場推廣可能。
[0017] (3)經(jīng)濟(jì)、社會效益高:試劑盒的開發(fā)有效填補(bǔ)商品化試劑盒的缺失，且市場前景 廣闊，在內(nèi)蒙古、新疆、貴州等山羊養(yǎng)殖區(qū)域具有廣泛應(yīng)用前景，可簡化Mmc所致疫病程序， 提高疫苗免疫效果，試劑盒的生產(chǎn)應(yīng)用將產(chǎn)生良好的經(jīng)濟(jì)和社會效益。
【附圖說明】
[0018] 圖1為本發(fā)明的Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒制備生產(chǎn)流程圖。
【具體實施方式】
[0019 ]本發(fā)明的實施例： 基于Mmc LppA蛋白的間接ELISA試劑盒原料及配方為： 酶標(biāo)板；Mmc標(biāo)準(zhǔn)陽性和標(biāo)準(zhǔn)陰性血清；重組蛋白為Mmc LppA基因通過大腸桿菌 Rosseta(DE3)表達(dá)系統(tǒng)獲得LppA蛋白，并通過鎳柱法蛋白純化試劑盒進(jìn)行重組蛋白純化， 純化目的蛋白經(jīng)包被緩沖液稀釋為1.5yg /lOOyL;包被緩沖液：Na2⑶3 1.59g、NaHC03 2.93g溶于去離子水中，定容至lOOOmL，調(diào)至p Η 9.5~9.8;酶標(biāo)二抗:兔抗羊以6-冊？；1\ PBST緩沖液：NaCl 8.0g、KCl 0.2g、KH2P〇4〇.2g、Na2HP〇4*12H20 2.9g、Tween-20 0.5mL溶 于800mL蒸餾水，調(diào)整pH為7 · 2~7 · 6，定容至lOOOmL;封閉緩沖液：lg~5gBSA溶于lOmL PBST 緩沖液;底物液A:N