人尿液α1-酸性糖蛋白檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本公開設及醫(yī)學免疫體外診斷領域，具體設及一種用膠乳增強免疫透射比濁法檢 測人尿液中α1-酸性糖蛋白的試劑盒。
【背景技術】
[0002] α1-酸性糖蛋白（al-acid glycoprotein,AAG，早期稱之為乳清粘蛋白）分子量近 40kD，含糖量約45%，pl為2.7-3.5，包括等分子的已糖、已糖胺和唾液酸。AAG是主要的急性 時相反應蛋白，在急性炎癥時增高，顯然與免疫預防功能有關。AAG由肝和某些腫瘤組織合 成。分解代謝首先經過唾液酸的分子降解而后蛋白質部分很快在肝中消失。AAG可W結合利 多卡因和普糞洛爾，在急性屯、肌梗死時AAG作為一種急性時相反應蛋白可W升高，而干擾藥 物劑量的有效濃度(如王克夷，1991)。
[0003] AAG是目前較為敏感的急性期反應的炎癥標志物，是急性時相反應物之一。其對炎 癥、感染反應早于體溫及白細胞數的變化，故廣泛用于臨床。
[0004] 2型糖尿病腎病是糖尿病的主要并發(fā)癥之一，也是近年來糖尿病患者死亡的主要 原因之一。如果能在2型糖尿病患者糖尿病腎病發(fā)生的早期及時作出診斷并進行干預性治 療，腎臟的微損病變可W得到好的控制甚至發(fā)生逆轉。目前，國內外普遍將24h尿白蛋白排 泄率測定作為糖尿病腎病早期診斷的重要指標。但是，最近一系列的研究報道卻對尿白蛋 白在預測和診斷糖尿病腎病中的可靠性提出了質疑，認為其特異性和敏感度并不是很理 想。將尿中的AAG作為輔助診斷指標之一，對2型糖尿病患者糖尿病腎病的發(fā)生發(fā)展有較好 的預測價值(如鞠北華等人，2013年;化ristiansen M.S等人2005;)。健康的人尿中的AAG的 含量為0.29至0.68mg/24h。高于一定的闊值，則腎組織損害不可逆轉，且腎功能受損加劇的 幾率很大。
[0005] 目前，市場上檢測α1-酸性糖蛋白的試劑盒由于靈敏度低，樣本僅限于血清，無法 檢測人尿液中α1-酸性糖蛋白（例如CN103076456A和CN103529221A中所公開的試劑盒）。針 對人尿中AAG含量較少，本領域所要解決的技術問題是提供一種膠乳增強免疫透射比濁法 檢測人尿液中酸性糖蛋白含量的試劑盒，其靈敏度高、重復性好、操作簡單、能夠進行批量 樣本檢測。

【發(fā)明內容】

[0006] 鑒于上述技術問題，本公開提供一種檢測人尿液中α1-酸性糖蛋白的試劑盒，該試 劑盒包含:第一試劑、第二試劑和任選地校準品。
[0007] 在一些實施方式中，所述第一試劑包含緩沖液、電解質、表面活性劑、穩(wěn)定劑、防腐 劑。在一些實施方式中，所述的第二試劑包含:緩沖液、包被有α1-酸性糖蛋白抗體的膠乳顆 粒、電解質、防腐劑。在一些實施方式中，所述校準品包含:緩沖液、濃度已知的α 1 -酸性糖蛋 白、穩(wěn)定劑、防腐劑、抗氧化劑。
[000引在一些實施方式中，所述第一試劑、第二試劑和校準品中緩沖液的抑在5.5至9.0 之間；例如5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5;在一些具體的實施方式中，緩沖液的抑在6.0至 7.5之間。在本申請上下文中，表述"在…之阿'包含端點值。
[0009] 在一些實施方式中，所述第一試劑、第二試劑和校準品中緩沖液的濃度在10至 lOOmmol/L 之間；例如，10、12、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100mmol/l;在一些 具體的實施方式中，濃度在10至25mmol/L之間。
[0010] 在一些實施方式中，第一試劑、第二試劑和校準品中緩沖液各自獨立地選自： TRIS/肥1緩沖液、PBS緩沖液、甘氨酸緩沖液、己比妥緩沖液及其組合。在一些具體的實施方 式中，緩沖液是TRIS/HC1緩沖液。
[0011] 在一些實施方式中，第一試劑、第二試劑和校準品中緩沖液的種類、濃度或pH值分 別是相同的或者是不同的。
[0012] 在一些具體的實施方式中，第一試劑中緩沖液是TRIS/HC1緩沖液，抑在7.0至7.5 之間，且濃度在15至25mmol/L之間；優(yōu)選為20mmol/L抑為7.5的TRIS/肥1緩沖液。
[0013] 在一些具體的實施方式中，第二試劑中緩沖液是TRIS/HC1緩沖液，抑在7.0至7.5 之間，且濃度在10至15mmo 1/L之間；優(yōu)選為1 Ommo 1/L抑為7.5的TRIS/肥1緩沖液。
[0014] 在一些具體的實施方式中，校準品中緩沖液是TRIS/肥1緩沖液，抑在6.0至6.5之 間，且濃度在10至15mmol/L之間；優(yōu)選為15mmol/L抑為6.0的TRIS/肥1緩沖液。
[0015] 在一些實施方式中，所述第一試劑中電解質的濃度在50至500mmol/L之間，例如 75、100、120、150、200、250、300、350、400、450mmol/L。在一些實施方式中，所述第二試劑中 電解質的濃度在 10至300mmol/L之間，例如 10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、150、 200、250、300111111〇1/1。在一些實施方式中，第一試劑和第二試劑中電解質各自獨立地選自： 氯化鋼、氯化儀、氯化鐘、硫酸儀及其組合。第一試劑和第二試劑中的電解質的種類或濃度 是相同的或者是不同的。在一些具體的實施方式中，電解質是250mmol/L氯化鋼。
[0016] 在一些實施方式中，第一試劑、第二試劑和校準品中防腐劑的濃度在O.lg/lOOml 至 Ig/lOOml 之間；例如 0.1、0.15、0.20、0.25、0.30、0.35、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0g/ 100ml。第一試劑、第二試劑和校準品中防腐劑各自獨立地選自：疊氮鋼、疊氮裡、山梨酸鐘、 亞硝酸鋼及其組合。所述第一試劑、第二試劑和校準品中的防腐劑的種類或濃度是相同的 或者是不同的。在一些具體的實施方式中，防腐劑是O.lg/lOOml的疊氮鋼。
[0017] 在一些實施方式中，所述第一試劑和校準品中穩(wěn)定劑的濃度在O.lg/lOOml至3g/ 100ml之間，例如0.1、0.2、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/100ml。在一些實施方式中，第一試 劑和校準品中穩(wěn)定劑各自獨立地選自：甘露糖、葡萄糖、殼聚糖、山梨醇及其組合。所述第一 試劑和校準品中的穩(wěn)定劑是相同的或者是不同的。在一些具體的實施方式中，第一試劑和 校準品中穩(wěn)定劑是0.1 g/lOOml的山梨醇。
[0018] 在一些實施方式中，第一試劑的表面活性劑的濃度在O.lg/lOOml至Ig/lOOml之 間；例如0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0g/100ml。在一些實施方式中，表面活性劑選自：非 離子表面活性劑、陰離子表面活性劑及其組合。非離子表面活性劑選自：Tween、化iton X- 100及其組合。陰離子表面活性劑選自：SDS、脂肪醇聚氧乙締橫酸鋼、聚茵腦橫酸鋼及其組 合。在一些具體的實施方式中，表面活性劑是0.1至0.5g/100ml的非離子表面活性劑。在一 些具體的實施方式中，表面活性劑是0.1 g/lOOml的Tween,優(yōu)選Tween-20或Tween-80。
[0019] 在一些實施方式中，校準品中抗氧化劑的濃度在O.lg/lOOml至5. Og/lOOml之間； 例如 0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5g/100ml。在一些實施 方式中，抗氧化劑選自：沒食子酸丙醋、二下基徑基苯、叔下基對徑基茵香酸及其組合。在一 些具體的實施方式中，抗氧化劑是O.lg/lOOml的二下基徑基苯。
[0020] 在一些實施方式中，α1-酸性糖蛋白抗體是單克隆抗體或多克隆抗體。所述α1-酸 性糖蛋白抗體選自：羊抗人抗體、兔抗人抗體、鼠抗人抗體、雞抗人抗體和鴨抗人抗體。
[0021] 在一些實施方式中，α1-酸性糖蛋白抗體在第二試劑中的濃度是lOmg/L至50mg/L 之間；例如 10、20、24、25、30、35、40、45、50111邑/1，優(yōu)選15至25111邑/1。
[0022] 在一些實施方式中，膠乳顆粒的粒徑在50nm至250nm之間，優(yōu)選lOOnm至200nm之 間，更優(yōu)選100至150nm，例如100、120、130、140、150nm。所述膠乳顆粒是簇基修飾的聚苯乙 締膠乳顆粒。在一些實施方式中，包被有α1-酸性糖蛋白抗體的膠乳顆粒濃度在0.1 g/lOOml 至 5.0g/100ml 之間；例如 0.1、0.2、0.3、0.5、0.6、0.8、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、 4.5g/100ml。在一些具體的實施方式中，包被有α1-酸性糖蛋白抗體的膠乳顆粒濃度是 0.1 g/lOOml或0.2g/100ml。在一些實施方式中，膠乳顆粒物理吸附至或化學交聯(lián)至α1-酸性 糖蛋白抗體。
[0023] 在一些實施方式中，所述校準品中α1-酸性糖蛋白的濃度在0.20mg/L至6.00mg/L 之間。可用于本公開試劑盒的校準品是市售校準品或者根據需要的濃度自行配制。技術人 員理解，校準品的用途在于繪制標準曲線，從而使未知濃度的待測樣本在標準曲線上得到 對應的讀值。通常而言，Ξ個已知濃度即可繪制標準曲線。在一些實施方式中，校準品包含3 至7不同的α1-酸性糖蛋白濃度。在一些實施方式中，校準品包含5不同的α1-酸性糖蛋白濃 度。盡管本申請中采用了特定的濃度，但是技術人員理解α1-酸性糖蛋白的濃度分別為，但 不限于0.0 Omg/L、0.20mg/L、1. OOmg/L、3. OOmg/L、4.50mg/L、6. OOmg/L。
[0024] 在一些具體的實施方式中，本公開設及一種用于檢測人尿液中α1-酸性糖蛋白的 膠乳增強免疫透射比濁試劑盒，其包含:試劑R1、試劑R2和5個已知濃度的α1-酸性糖蛋白校 準品，其中：
[00巧]?試劑R1，包含：
[00%]緩沖液 10至 100mm〇l/L，pH 5.5-9.0;
[0027] 電解質 50 至 500mmol/l;
[0028] 表面活性劑0.1 g/lOOml至Ig/lOOml;
[00巧]穩(wěn)定劑0.1 g/lOOml至3g/100ml;和
[0030] 防腐劑 O.lg/lOO