一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯(lián)免疫檢疫方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]發(fā)明屬于動(dòng)物疾病診斷試劑領(lǐng)域，具體涉及一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯(lián)免疫檢疫方法。
【背景技術(shù)】
[0002]鴨疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer，RA)是嚴(yán)重危害水禽養(yǎng)殖業(yè)的重要病原性細(xì)菌。由于RA的耐藥性嚴(yán)重，其導(dǎo)致疾病的最佳防控策略是菌苗免疫預(yù)防。我國有關(guān)部門僅批準(zhǔn)滅活菌苗可商品化用于水禽養(yǎng)殖。由于菌苗在生產(chǎn)中的應(yīng)用，也導(dǎo)致了鴨疫里默氏菌感染鴨與滅活菌苗免疫鴨在檢疫中難于區(qū)分。本發(fā)明公開一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯(lián)免疫檢疫方法，能區(qū)分鴨血清中特異性抗體是鴨疫里默氏菌感染后產(chǎn)生或免疫接種滅活菌苗后產(chǎn)生，也能用于鴨疫里默氏菌感染康復(fù)鴨的鑒別。
[0003]鴨是否感染鴨疫里默氏菌，可以用鴨疫里默氏菌分離鑒定、多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)、血清抗體檢測等方法進(jìn)行確證，但現(xiàn)有的相關(guān)方法均存在不同的缺點(diǎn)，不能作為檢疫方法。
[0004](I)鴨疫里默氏菌的分離鑒定:可以確切診斷該細(xì)菌的臨床感染，但存在操作復(fù)雜、耗時(shí)長、使用抗菌藥物治療的動(dòng)物和康復(fù)期動(dòng)物的假陰性率高，不適合于檢疫等。
[0005](2)多聚酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù):操作復(fù)雜，技術(shù)要求高，需要多種特殊儀器，只適于鴨感染后帶菌期檢疫、不適合于康復(fù)后的非帶菌動(dòng)物的鑒別。
[0006](3)血清抗體檢測:檢測抗體的血清學(xué)方法很多，但在鴨疫里默氏菌感染中應(yīng)用較多的要是酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)。已有血清抗體檢測方法不能區(qū)分血清中鴨疫里默氏菌感染和滅活菌苗免疫誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體，同時(shí)存在細(xì)菌血清型的差異，也就不能用于鴨疫里默氏菌感染鴨的檢疫。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的在于提供了一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯(lián)免疫檢疫方法。
[0008]本發(fā)明的一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯(lián)免疫檢疫方法，包括以下步驟:
[0009](I)將鴨疫里默氏菌肽酶S8蛋白10.0yg/ml作為檢測抗原在37°C振蕩包被聚苯乙烯酶標(biāo)板2小時(shí)；
[0010](2)洗滌后用2 %牛血清白蛋白在37 0C振蕩封閉30分鐘；
[0011](3)洗滌，將待檢血清用磷酸鹽緩沖液(0.0lM pH 7.4)按1: 200稀釋后加入酶標(biāo)板孔振蕩反應(yīng)45分鐘；
[0012](4)洗滌，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鴨IgG溶液振蕩反應(yīng)45分鐘；
[0013](5)洗滌，加入TMB顯色液避光振蕩反應(yīng)15分鐘；
[0014](6)加入終止液后混勻，酶標(biāo)儀在波長450nm測定吸光值(OD45Q值)。
[0015]上述本發(fā)明的檢疫方法，步驟(I)的檢測抗原的稀釋液為0.05MPH9.6的碳酸鹽緩沖液;步驟(2) (3) (4) (5)中所述洗滌的洗滌液為含0.05%吐溫-20的0.0IM pH7.4磷酸鹽緩沖液，洗滌3次，每次3分鐘；步驟(2)中2 %牛血清白蛋白的稀釋液為0.0IM pH7.4磷酸鹽緩沖液;步驟(6)的終止液為2.0M硫酸。
[0016]本發(fā)明的檢疫方法，檢測結(jié)果，當(dāng)鴨血清檢測的OD45Q值?0.130，則表明鴨感染鴨疫里默氏菌;檢測的0D450值<0.130，則表明鴨未染鴨疫里默氏菌。
[0017]本發(fā)明的另一目的在于提供了一種鴨疫里默氏菌感染鴨的酶聯(lián)免疫檢疫方法的檢測抗原，包括:
[0018](I)鴨疫里默氏菌肽酶S8基因或部分基因片段的原核和真核表達(dá)的重組蛋白；(2)從鴨疫里默氏菌純培養(yǎng)物中分離純化的肽酶S8蛋白及其片段。
【具體實(shí)施方式】
[0019]以下實(shí)施例用于進(jìn)一步理解本發(fā)明的實(shí)質(zhì)，但不以任何方式限制本發(fā)明的范圍。
[0020]實(shí)施例1檢測抗原的制備
[0021](I)鴨疫里默氏菌肽酶S8基因部分序列的克隆與分析
[0022]根據(jù)鴨疫里默氏菌基因組DNA序列中肽酶S8基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)一對帶有限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)的特異性引物SL ( 5-GGATCCCTCAATGCCTAGCGGTATGA-3 )和SR( 5-AAGCTTACACCTTTAGGCTGTTGGGT-3)，以鴨疫里默氏菌AF株(血清2型)細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行PCR。
[0023]PCR 體系(25yL):1O X Buffer 2.5yL、MgCL2 (25mM) 2.0yL、dNTPs (2.5mM) 2.0yL、弓丨物 SL(1uM) 2.0yL、引物 SR(1uM) 2.0yL、Taq 酶(5U/yL)0.25yL、模板 DNA 2.0yUddH2O14.25yLo
[0024]PCR 條件:95°C 預(yù)變性 2min;94°C 變性 lmin、57°C 退火 lmin、72°C 延伸 2min，30 個(gè)循環(huán)；72°C 延伸 lOmin。
[0025]PCR產(chǎn)物經(jīng)I %瓊脂糖電泳，切膠回收目的DNA，與T載體(pUCm-T)連接構(gòu)建重組質(zhì)SpUC-S，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆后測序。
[0026]獲得鴨疫里默氏菌AF株細(xì)菌S基因的部分序列為:
[0027]
GGATCCCTCAATGCCTAGCGGTATGACGGTAATAGGAGATCAGGGCTCTTCTATTCTAGATTGGAATCTTACAGGGG
TATATAAGAAGAGCGGAGAGTATGGTGTAAGATCTTATGCGTGGTTTATGAATCCGTTTGATGCCAATAGTATACTG
ATAACTCCTAAACTAAGAAAAGGAGCAGAAGTTCTTAACTTTAATGTATGGCATCGTTACAAAGAAAGATATGATGT
CTATATAGTGGAAGCTCCAGCTTCTGGAAACGCTCCTACAGCGGAGGAAGTGAAAGCTGGGCATAAAGTCTATACCT
TTGAAGCCACTGGAACTAATCCTACATTTAAGTTGGAGTCTGTTAATATCAAAAACTATACAAACAAAGATTTCTTT
GTAGCGTTCCACCACAGAACTAAGAAAGACGATAATGGCTTTATACTAGCATTAGATGATATAGAAGTAGGATATGA
TAACTCTGTGGACGGAAAAGTAGGGGCAACTGTAGGTACTCAAACTCTAAGCAAAGAGGCGCTTCCTGATTTTAAAG
CCGACTTCTTAAAAGGAGATAAGCTAGTAACTAGAGAGATGCTGTTACCAGAAACTTCACTGAATAGTGGTATAGGC
AGCAAAGTTTCTTTCGGAATATCTACTGTACCTCATTTAGTAGGTTACGAAGTGGTTAAAGATGGAACTAAGGTAAG
TGATATAAACGATTACAACACCCGTCTATACAATGAAACAATGACCCAAAATGGTACTTATACTTACGATGTATATG
CGGTATATTCTGACGGAGTTAAGTCTGATAAGCAAACGGTAGTTGTTAATATCACCACAATTGCTACATCAGAAGTT
GATGCTAATACAGGATTAAAGGTGTATCCAAACCCATCTAATGGTAATTTTGTAGTAGAAGCAGTTTCTACTGTATC
TGCACTGAAAGCTAGTGTTTACGATATGTCTGGAAAACAGATTTTATCCAACGAGTACAAA