別相當于圖2中表示的標記與符號。
[0093 ]圖4表示了液滴封入形態(tài)的其他的例子。
[0094] 圖5是通過在實施例1中進行的核酸擴增反應而得到的擴增產(chǎn)物的利用電泳檢測 的結(jié)果。
[0095] 圖6是在參考例1中，（a-Ι)向硅油中添加熒光色素的情況、（b-Ι)未添加的情況的 用紫外線照射觀察PCR反應結(jié)束后的熒光的圖像。
[0096] 圖7是在裝滿液滴封入介質(zhì)3的容器4中封入的、由含有磁性粒子8的PCR反應液構(gòu) 成的液滴11，通過磁鐵61使其移動來實施PCR，并且在PCR中用于實時地熒光檢測PCR產(chǎn)物的 機器構(gòu)成的示意圖。
[0097] 符號說明：
[0098] 1封入液滴
[0099] 3液滴封入介質(zhì)
[0100] 4 容器
[0101] 41輸送面
[0102] 5加熱源
[0103] 61磁場施加機構(gòu)
[0104] 8磁性體粒子。
【具體實施方式】
[0105] [1.液滴]
[0106] 本發(fā)明中所涉及的液滴是指一種液體團塊，所述液體團塊具有由形成液滴的液體 的內(nèi)外壓力差、和基于構(gòu)成液滴的液體的分子間力而產(chǎn)生的表面張力的平衡所確定的形狀 (大體上為球狀或其變形形狀）。
[0107] [1-1.水系液體]
[0108] 作為在本發(fā)明中形成液滴的液體，只要是相對于后述的液滴封入介質(zhì)為不溶性或 難溶性的水系液體即可，可以水、水溶液或懸濁液的形態(tài)提供。作為水系液體的構(gòu)成成分， 包括供給于能夠適用于本發(fā)明的反應以及處理的任何成分。
[0109] 作為反應，例如可以是化學反應以及生物化學反應。作為化學反應，包括伴隨在水 系進行的化學變化的任何反應。作為物質(zhì)變化，包括無論是化合、分解、氧化還是還原。作為 生物化學反應，包括伴隨生物體物質(zhì)的變化的任何反應。例如可以是核酸、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖 等生物物質(zhì)的合成系統(tǒng)、代謝系統(tǒng)以及免疫系統(tǒng)。
[0110] 作為處理，與否伴隨有物質(zhì)變化無關，包括任何處理。作為物質(zhì)變化，也無論是化 學變化還是物理變化。例如可以舉出以下處理:在上述的反應和分析之前進行的預處理、細 分（分離）處理、溶解處理、混合處理、稀釋處理、攪拌處理、溫度調(diào)節(jié)（加熱以及冷卻）處理 等。
[0111] 作為更具體的例子，可以舉出用于進行核酸擴增反應的核酸擴增反應液，含有需 要擴增的核酸的試樣，用于提取核酸的核酸提取液，用于清洗核酸的磁性體粒子清洗液以 及用于游離核酸的核酸游離液等。
[0112] 以下，關于作為比上述更具體的例子所例舉的水系液體以及供給水系液體的反應 和處理，將在下面進一步說明。
[0113] [1-1-1.核酸擴增反應液]
[0114] 對于本發(fā)明中的核酸擴增反應液，包括用于一般的核酸擴增反應的各種的要素， 還至少包括需要擴增的核酸以及磁性體粒子。
[0115] 如后面所述，由于核酸擴增反應不是特殊限定的反應，所以用于核酸擴增反應的 各種要素，基于后面例出的公知的核酸擴增法等，本領域的技術(shù)人員能夠適當?shù)貨Q定。通 常，包括MgCl 2、KCl等的鹽類、引物、脫氧核苷酸類、核酸合成酶以及pH緩沖液。另外，上述的 鹽類可以適當?shù)刈兏褂闷渌柠}類。另外，有時會進一步添加二甲基亞砜等為了減少非 特異性引發(fā)的物質(zhì)。
[0116] 對于需要擴增的核酸的來源沒有特殊的限定。另外，能夠由含有另外準備的核酸 的試樣來進行適當?shù)念A處理和制備。作為該預處理，例如可以舉出從含有核酸的試樣中進 行核酸提取的處理、對吸附了核酸的磁性體粒子進行清洗的處理、以及進行從磁性體粒子 游離核酸的處理等、不受封入介質(zhì)中含有的熒光色素的影響的處理。
[0117] 作為含有需要擴增的核酸的試樣，沒有特殊的限定，例如可以是如動植物組織、體 液、排泄物等的來自生物體的試樣，細胞、原蟲、真菌、細菌、病毒等核酸含有體。體液包括血 液、髓液、唾液、乳汁，排泄物包括糞便、尿、汗，也可以是它們的混合。細胞包括血液中的白 血球、血小板、或口腔細胞及其他的粘膜細胞的剝離細胞，也可以是它們的混合。另外，含有 核酸的試樣，例如也可以細胞懸濁液、均漿、與細胞溶解液的混合液等形態(tài)進行制備。
[0118] 而且，在本發(fā)明中，有時把含有核酸的試樣的一種形態(tài)或把含有核酸的試樣經(jīng)過 預處理而得到的試樣，記述為含有核酸的液體。
[0119] 本發(fā)明的核酸擴增反應液中，除了上述成分，還可含有封閉劑。使用封閉劑可出于 防止因核酸聚合酶向反應容器的內(nèi)壁或磁性體粒子表面等吸附而導致失活的目的而使用。
[0120] 作為封閉劑的具體例子，例如可以是牛血清白蛋白（即，BSA)及其他的白蛋白、明 膠（即，變性膠原蛋白）、酪蛋白以及聚賴氨酸等蛋白質(zhì)、或肽(上述的任意一種都無論是天 然還是合成）。
[0121] 對本發(fā)明所涉及的核酸擴增反應，沒有特殊的限定，例如，可使用PCR法(美國專利 第4683195號說明書，美國專利4683202號公報，美國專利4800159號公報，美國專利4965188 號公報），LCR法（美國專利第5494810號公報），Qi3法(美國專利第4786600號公報），NASBA法 (美國專利第5409818號公報）LAMP法（美國專利第3313358號公報），SDA法（美國專利第 5455166號公報），RCA法(美國專利第5354688號公報），ICAN法（日本國專利第3433929號公 報），TAS法（日本國專利第2843586號公報)等。
[0122] 這些核酸擴增反應所需要的反應液的組成和反應溫度，可由本領域的技術(shù)人員適 當?shù)剡M行選擇。
[0123] 在實時核酸擴增方法中，用能夠?qū)﹄p鏈DNA進行染色的熒光色素而標記擴增產(chǎn)物， 由此能夠觀察到由加熱該雙鏈DNA而產(chǎn)生的熒光色素的變化。
[0124] 作為實時核酸擴增法的檢測法，可例舉出下列的方法。
[0125] 例如，在通過高特異性的引物而僅使目的目標擴增時，可采用使用SYBR(注冊商 標)GREEN I等的嵌入劑法。
[0126] 通過與雙鏈DNA結(jié)合而發(fā)出熒光的嵌入劑，與通過核酸擴增反應而使合成的雙鏈 DNA結(jié)合，并通過激發(fā)光的照射而發(fā)出熒光。通過檢測該熒光強度，能夠?qū)U增產(chǎn)物的生成 量進行監(jiān)控。這個方法，不需要設計、合成相對于目標為特異性的熒光標記探針，可簡便地 利用于各種各樣的目標的測定。
[0127] 另外，在需要對很相似的序列進行區(qū)別、檢測的情況下，或在進行SNPs分型的情況 下，采用探針法。作為一個例子，有將用熒光物質(zhì)來修改5'末端，用猝滅物質(zhì)來修改3'末端 的寡聚核苷酸作為探針使用的TaqMan (注冊商標)探針法。
[0128] TaqMan探針，在退火階段與模板DNA特異性雜交，但由于在探針上存在猝滅劑，所 以即使照射激發(fā)光也會抑制熒光發(fā)光。在延伸反應階段，利用TaqDNA聚合酶具有的5Z-3' 核酸外切酶活性，如果與模板雜交的TaqMan探針被分解，則熒光色素就會從探針處游離出， 由猝滅劑產(chǎn)生的抑制被解除而使熒光發(fā)光。通過測量該熒光強度，能夠監(jiān)控擴增產(chǎn)物的生 成量。
[0129] 以下敘述通過這樣的方法而用實時PCR對DNA進行定量的原理。首先，將進行了階 段稀釋的、濃度為既知的標準樣品作為模板使用來進行PCR。然后，求出達到一定的擴增產(chǎn) 物量的循環(huán)數(shù)(threshold cycle ;Ct值）。以該Ct值作為橫軸，以初始的DNA量作為縱軸作 圖，制作出標準曲線。
[0130] 關于未知濃度的樣品，也在同樣條件下進行PCR反應并求出Ct值。從該值和前述的 標準曲線，能夠測量出樣品中的DNA量。
[0131] 并且，若從熱變性到退火進行激發(fā)光的照射，也能得到擴增產(chǎn)物的融解曲線。
[0132] 由核酸擴增反應產(chǎn)生的雙鏈DNA，基于DNA的長度及其堿基序列而具有固有的Tm 值。即，若使含有結(jié)合了熒光色素的DNA的液滴溫度慢慢上升，則可觀測到熒光強度急劇地 減少的溫度。如果查出熒光強度的變化量，其溫度峰與基于堿基序列和長度而規(guī)定的Tm值 大體上相符。由此，可從陽性數(shù)據(jù)從排除不是目的基因，而是例如產(chǎn)生引物二聚體而觀測到 的數(shù)據(jù)等（即，假陽性數(shù)據(jù)）。在基因檢查中，由于因試樣中的夾雜物而產(chǎn)生非特異反應的情 況較多，所以排除這樣的假陽性是很重要的。由此，也能夠判斷生成的擴增產(chǎn)物是否是標的 基因固有。
[0133] [卜卜2 ·核酸提取液]
[0134] 作為用于進行核酸的提取的核酸提取用液，可以舉出含有離液序列高的物質(zhì)、 EDTA、Tris HC1等緩沖液。作為離液序列高的物質(zhì)，例如可以是鹽酸胍，異硫氰酸胍，碘化 鐘，尿素等。
[0135] 從含有核酸的試樣中進行核酸提取的具體方法，可以由本領域的技術(shù)人員適當?shù)?決定。在本發(fā)明中，由于在液滴封入介質(zhì)內(nèi)的核酸的搬運中使用的是磁性體粒子，因此核酸 提取方法也優(yōu)選采用使用磁性體粒子的方法。例如，參考日本國特開平2-289596號公報，能 夠?qū)嵤暮泻怂岬脑嚇又惺褂么判泽w粒子進行的核酸的提取、純化的方法。
[0136] [卜^·清洗液]
[0137] 作為清洗用液，只要是能夠在核酸吸附在磁性體粒子表面的狀態(tài)下，將含核酸試 樣中所含有的核酸以外的成分(例如蛋白質(zhì)、糖類等），或?qū)㈩A先進行了核酸提取等其他處 理中所使用的試劑及其他成分溶解的溶液即可。具體例如可以是氯化鈉、氯化鉀、硫酸銨等 高鹽濃度水溶液，乙醇、異丙醇等醇水溶液等。
[0138] 清洗吸附了核酸的磁性體粒子的具體方法，本領域的技術(shù)人員也可以適當?shù)貨Q 定。另外，吸附了核酸的磁性體粒子的清洗次數(shù)，本領域的技術(shù)人員可按在核酸擴增反應的 時候不會產(chǎn)生所不希望的妨礙的程度而進行適當?shù)剡x擇。另外，出于同樣的觀點也可省略 清洗工序。
[0139] 由清洗液構(gòu)成的液滴，可制備至少與清洗次數(shù)相同的個數(shù)。
[0140] [1-1-4.核酸游離液]
[0141] 作為核酸游離液，可以使用水或含有低濃度的鹽的緩沖液。具體可以用T r i s緩沖 液、磷酸緩沖液、蒸餾水等。
[0142] 從吸附了核酸的磁性體粒子上使核酸游離的具體方法，也可以由本領域的技術(shù)人 員適當?shù)貨Q定。
[0143] [1-1-5.其他的水系液體]
[0144] 關于上述以外的任何反應以及處理，各自的水系液體的組成，也能夠由本領域的 技術(shù)人員容易地決定。
[0145] [1-2.液滴的量]
[0146] 作為完全被封入在封入介質(zhì)中的液滴的量，例如可以為0. lyL~10yL或左右。
[0147] [1-3.磁性體粒子]
[0148] 在本發(fā)明的方法中，為了因磁場的變動可使液滴移動，可以使磁性體粒子包含在 液滴中。磁性體粒子，通常其表面具有親水性基團。另外，磁性體粒子，最好是以使其包含在 液滴中的形態(tài)預先封入在容器中的液滴封入介質(zhì)中，如果是作為用于制作本發(fā)明的裝置的 試劑盒而被提供的情況，則也可以是包括在該試劑盒中的容器或液滴封入介質(zhì)或者作為其 材料另外添加的物品之一。
[0149] 磁性體粒子，只要是對磁有反應的粒子就無需特別地限定，例如可以是磁鐵、γ-氧化鐵、錳鋅鐵氧體等具有磁性體的粒子。另外，對于磁性體粒子，只要具有可與供給上述 反應或處理的物質(zhì)形成特異性結(jié)合的化學結(jié)構(gòu)，例如氨基、羧基、環(huán)氧基、抗生素蛋白、生物 素、毛地黃毒苷、Α蛋白、G蛋白、絡合物化的金屬離子，或者抗體的表面即可，也可以具有利 用靜電力、范德華力而表現(xiàn)與該物質(zhì)特異性結(jié)合的形態(tài)的表面。由此，能夠有選擇地將供給 反應或處理的物質(zhì)吸附到表面上。
[0150] 作為磁性體粒子在表面具有的親水性基團，例如可以是羥基、氨基、羧基、磷酸基、 橫酸基等。
[0151] 磁性體粒子，除了上述的以外，還可包括可由本領域的技術(shù)人員適當?shù)剡M行選擇 的各種要素來構(gòu)成。例如，作為表面具有親水性基團的磁性體粒子具體的形態(tài)，優(yōu)選可舉出 由磁性體與硅及/或陰離子交換樹脂的混合物構(gòu)成的粒子、以硅及/或陰離子交換樹脂覆蓋 表面的磁性體粒子、介由氫硫基以具有親水性基團的金覆蓋了表面的磁性體粒子、含有磁 性體并介由氫硫基在表面上具有親水性基團的金粒子。
[0152] 作為在表面具有親水性基團的磁性體粒子的大小，平均粒徑可為0. Ιμπι~500μηι左 右。若平均粒徑較小，則磁性體粒子容易以在液滴中分散的狀態(tài)存在。
[0153] 作為磁性體粒子在市場上銷售的例子，例如有作為東洋紡銷售的Plasmid DNA Purification Kit MagExtractor-Plasmid-的構(gòu)成試劑的Magnetic Beads。在作為這樣的 試劑盒的構(gòu)成試劑銷售的情況下，優(yōu)選通過將含有磁性體粒子的產(chǎn)品原液用純水(例如10 倍量左右)使其懸浮來進行清洗。在這樣的清洗中，在以純水懸浮之后，可以通過離心操作 而除去上清液來進行，可反復進行懸浮以及除去上清液。清洗后的磁性體粒子，能以分散在 純水中的狀態(tài)而使用于本發(fā)明。
[0154] 這樣的磁性體粒子通過被包入液滴內(nèi)并進一步使磁場變化，能夠與該液滴一起向 磁場機構(gòu)的移動方向移動。由此，液滴能夠在保持液滴狀態(tài)的同時進行移動。
[0155] [2.液滴封入介質(zhì)]
[0156] 作為液滴封入介質(zhì)，使用相對于構(gòu)成液滴的液體為不溶性或難溶性的化學惰性的 物質(zhì)?；瘜W惰性物質(zhì)是指在液滴的分選(分離）、混合、溶解、稀釋、攪拌、加熱、冷卻等各種操 作中，對構(gòu)成液滴的液體沒有化學影響的物質(zhì)。本發(fā)明中的液滴封入介質(zhì)更具體而言至少 在液滴操作前是凝膠狀態(tài)，并且在為該凝膠狀態(tài)時以及超過凝膠-溶膠轉(zhuǎn)化點而為凝膠狀 態(tài)時的兩者情況下，相對于構(gòu)成液滴的核酸擴增反應液均為不溶性或難溶性。在本發(fā)明中， 通常使用向非水溶性或水難溶性的液體物質(zhì)中添加膠凝劑而被凝膠化而得到的材料。
[0157] 另外，當在液滴封入介質(zhì)中使后述的熒光物質(zhì)溶解而使用的情況下，本領域的技 術(shù)人員能夠適當?shù)剡x擇能夠溶解該熒光物質(zhì)的材料。例如，作為具有某