一種菌類中β-葡聚糖的檢測方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于一種檢測方法，特別是一種應(yīng)用于菌類產(chǎn)品尤其是姬松茸產(chǎn)品中以β-葡聚糖的檢測為核心技術(shù)的質(zhì)量控制的標(biāo)準(zhǔn)及方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 姬松茸（又名巴西蘑菇），原產(chǎn)巴西、秘魯。它是一種夏秋生長的腐生菌，生活在高 溫、多濕、通風(fēng)的環(huán)境中，具杏仁香味，口感脆嫩。姬松茸菌蓋嫩，菌柄脆，口感極好;蛋白質(zhì) 組成中包括18種氨基酸，人體的8種必需氨基酸齊全，還含有多種維生素和麥角留醇。它對(duì) 抑制腫瘤(尤其是腹水癌）、醫(yī)療痔痿、增強(qiáng)精力、防止心腦血管疾病等都有療效。
[0003] 因此隨著姬松茸市場擴(kuò)大，原料供不應(yīng)求，市場上以假亂真、以次充好的現(xiàn)象日益 增多，對(duì)其質(zhì)量控制提出了更高的要求。目前行業(yè)內(nèi)"姬松茸"同類產(chǎn)品都是以"粗多糖"作 為含量測定指標(biāo)，所采用的檢測方法分為"硫酸-蒽酮UV法"和"苯酚-硫酸UV法"，以測定粗 多糖含量為質(zhì)量指標(biāo)，檢測原理相似，硫酸-蒽酮和苯酚-硫酸溶液都可以與多種糖類進(jìn)行 顯色反應(yīng)，常用于總糖的測定，一般常用于樣品中糖的類型未知或結(jié)構(gòu)多樣、只能以葡萄糖 折合計(jì)算結(jié)果，該方法測定結(jié)果粗糙，無法分辨各種不同種類來源的糖類，專屬性不強(qiáng)，而 測定過程中不可避免的受到其他輔料、添加劑中糖類的干擾，比如淀粉、糊精等多糖及甜味 劑糖精，這些都會(huì)對(duì)粗多糖含量的測定有很大的干擾。
[0004] 另外檢測方法中，粗多糖的檢測是使用紫外分光光度計(jì)測定，精密度低，檢測限高 故而靈敏度低，而且易受環(huán)境干擾。
[0005] 因此對(duì)于姬松茸質(zhì)量的檢測，要想真正達(dá)到判定真?zhèn)蝺?yōu)劣的目的，需要選用專屬 性更強(qiáng)的指標(biāo)、最好這個(gè)指標(biāo)能夠與姬松茸的生物營養(yǎng)活性相關(guān)，如能找到具有專屬性的 姬松茸中活性營養(yǎng)成分的定量檢測方法及指標(biāo)當(dāng)然最好，如不能找到專屬性強(qiáng)的定量指 標(biāo)，則就需要選擇與活性營養(yǎng)成分高度相關(guān)的特征成分的定量方法及指標(biāo)，同時(shí)采用一種 定性方法強(qiáng)化該定量方法的專屬性，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行定性和定量的檢測，方能實(shí)現(xiàn)既定真?zhèn)?且判優(yōu)劣的目標(biāo)，另外考慮到實(shí)際應(yīng)用中的切實(shí)可行、通用方便，上述定性定量方法的檢測 限要更低，而精密度要高。
[0006] β-葡聚糖是在微生物和植物中廣泛存在的一種多糖，是組成高等植物、酵母菌和 真菌細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)大分子之一，也是姬松茸中一種重要的特征指標(biāo)，葡聚糖作為姬松茸 所含有的抗腫瘤及增強(qiáng)免疫功能成分，葡聚糖含量與功效成正比關(guān)系，因此選擇該項(xiàng)指 標(biāo)對(duì)產(chǎn)品的功效評(píng)價(jià)具有現(xiàn)實(shí)意義。因此成為了申請人在研究姬松茸及其相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量控 制中一項(xiàng)重要的檢測指標(biāo)。
[0007] 但是，僅僅以β-葡聚糖HPLC含量測定方法，因目前該類方法的局限性，仍無法完全 排除其他糖類的干擾，不能確定所測定葡聚糖含量是否真為葡聚糖的含量，從而也就 無法對(duì)產(chǎn)品是否含有菌類，特別是是否含有姬松茸作出判斷，從真?zhèn)紊暇褪紫炔荒茏鞒雠?斷，則含量值對(duì)優(yōu)劣的評(píng)價(jià)也就失去了意義。
[0008] 為此，我們經(jīng)過廣泛大量的技術(shù)調(diào)研與實(shí)驗(yàn)摸索，尋找發(fā)明出對(duì)含有菌類特別是 姬松茸的產(chǎn)品進(jìn)行紅外光譜特征指紋圖譜掃描的方法，發(fā)現(xiàn)定性結(jié)果將對(duì)產(chǎn)品是否為姬松 茸制品具有鑒別價(jià)值，而且在紅外光譜指紋掃描圖譜定性試驗(yàn)中，我們確定該指紋圖譜檢 測可以不受糊精等糖類輔料的干擾，依然顯示其特征吸收峰。因此采取紅外光譜指紋圖譜 掃描定性方法與β-葡聚糖HPLC定量方法同步應(yīng)用于姬松茸產(chǎn)品質(zhì)量控制分析，可以成功地 彌補(bǔ)定量測試結(jié)果在真?zhèn)闻袛嗌系牟蛔阒帲鰪?qiáng)其專屬性，定性與定量方法相配合形成 的檢測評(píng)價(jià)體系，可以保證整體測定方法的客觀性及可靠性。從而實(shí)現(xiàn)了以檢測β-葡聚糖 為手段，進(jìn)而評(píng)價(jià)姬松茸相關(guān)產(chǎn)品品質(zhì)的質(zhì)量真?zhèn)蝺?yōu)劣同步評(píng)價(jià)方法，從而真正建立起了 能夠反映菌類產(chǎn)品、特別是姬松茸類產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的指控方法和標(biāo)準(zhǔn)體系。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了一種菌類中β-葡聚糖的檢測方法，所述檢測方法由菌類中β-葡聚糖 的紅外光譜定性方法和菌類葡聚糖的高效液相色譜定量方法組成，其中，所述紅外光譜 定性方法包括如下步驟：1)將所述菌類樣品與KBr按照1:10-50的質(zhì)量比例混合研磨至均 勻，置于樣品杯中，壓成透明薄片；2)以儀器內(nèi)置背景為參比，掃描波長范圍4000-450(3!!^， 掃描累積次數(shù)16-32次，分辨率4CHT 1，得到所述樣品的紅外光譜;所述定量方法包括如下步 驟a)準(zhǔn)確稱取0.4g樣品至20ml的帶螺帽的試管中，加入6.0ml的鹽酸（37%)，擰緊螺帽并 震蕩，得到均一的懸浮液;b)將試管放入30 °C水浴45min，每15min震蕩混合1次，將懸浮物轉(zhuǎn) 移到200ml杜氏瓶中，用100-120ml的水分幾次洗滌試管，洗滌液并入杜氏瓶中；c)將杜氏瓶 放入高壓滅菌鍋，121°C，60min，取出冷卻后，用氫氧化鈉溶液將溶液pH調(diào)至6-7，最后定容 到250ml，過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液;d)取供試品溶液5-20ul，注入液相色譜儀，儀器 條件:高效液相色譜儀Agilentl260,蒸發(fā)光散射檢測器Agilent 1260 Infinity ELSD，色 譜柱6.5mmX300mm waters sugar pak_l，柱溫70_90°C，流動(dòng)相為 100%水，流速為0.5-lml/min，蒸發(fā)光散射檢測器檢測條件Evaporator Temp:70_90°C，Nebulizer Temp:70-90 °C，Gas Flow Rate:0.8-1.0SLM，得到所述樣品的高效液相色譜。
[0010]申請人采用了紅外光譜定性測定方法和高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器(HPLC-ELSD)定量聯(lián)合方式進(jìn)行了姬松茸的檢測。
[0011] 首先建立IR紅外光譜法分析測定姬松茸產(chǎn)品中β-葡聚糖的定性方法，首先選定了 葡聚糖的標(biāo)準(zhǔn)品（SIGMA)適量和含有已知輔料配比的樣品適量，將菌類樣品與KBr以質(zhì)量 比1:10-50分別配制一系列樣品，置于樣品杯中，使用壓片機(jī)壓成透明薄片；以儀器SHIMADZ 島津紅外光譜儀（配有光纖探頭測樣附件）中的內(nèi)置背景為參比，掃描波長范圍4000-450〇1^，掃描累積次數(shù)16-32次，分辨率4CHT 1，得到所述樣品的紅外光譜。
[0012] 結(jié)果發(fā)現(xiàn)：
[0013]含有β-葡聚糖標(biāo)準(zhǔn)品的試樣在750-lOOOcnf1，分辨率為4CHT 1，波長范圍中有特征 吸收峰，即標(biāo)準(zhǔn)品也在選定波長中所出現(xiàn)的特定吸收峰，且在指紋區(qū)SSgtlOcnf1的位置有 較強(qiáng)的特征吸收峰。
[0014] 因此本發(fā)明提供了一種方法，所述方法中包含有判斷該菌類樣品中含有β-葡聚糖 的標(biāo)準(zhǔn)為：
[0015] 1、觀察在750-1000cm-S分辨率為4cm-S波長范圍中有特征吸收峰。
[0016] 2、觀察指紋區(qū)指紋區(qū)889±10cnf1的位置是有較強(qiáng)的特征吸收峰。
[0017]滿足以上特征才能判定樣本中含有β-葡聚糖。
[0018] 即，本發(fā)明提供了一種菌類中β-葡聚糖的檢測方法，所述檢測方法由菌類中β-葡 聚糖的紅外光譜定性方法和菌類葡聚糖的高效液相色譜定量方法組成，該紅外光譜定性 方法包括：
[0019] 1)將所述菌類樣品與KBr按照1:10-50的質(zhì)量比例混合研磨至均勾，置于樣品杯 中，壓成透明薄片；
[0020] 2)以儀器內(nèi)置背景為參比，掃描波長范圍4000-450(3!!^，掃描累積次數(shù)16-32次，分 辨率4CHT 1，得到所述樣品的紅外光譜；
[0021] 3)判斷該菌類樣品中是否含有β-葡聚糖;其中，判斷該菌類樣品中是否含有β-葡 聚糖的標(biāo)準(zhǔn)為:Α、在750-lOOOcnf 1，分辨率為4CHT1，波長范圍中有特征吸收峰;Β、指紋區(qū)889 ±10〇!^的位置有特征吸收峰;滿足以上A和B特征即判斷為該菌類樣品中含有β-葡聚糖； [0022]所述定量方法包括：
[0023] a)準(zhǔn)確稱取0.4g樣品至20ml的帶螺帽的試管中，加入6.0ml的37%的鹽酸（質(zhì)量百 分比），擰緊螺帽并震蕩，得到均一的懸浮液；
[0024] b)將試管放入30°C水浴45min，每15min震蕩混合1次，將懸浮物轉(zhuǎn)移到200ml杜氏 瓶中，用100-120ml的水分幾次洗滌試管，洗滌液并入杜氏瓶中；
[0025] c)將杜氏瓶放入高壓滅菌鍋，121°C，60min，取出冷卻后，用氫氧化鈉溶液將溶液 pH調(diào)至6-7，最后定容到250ml，過濾，取濾液作為供試品溶液；
[0026] d )取供試品溶液5 - 2 0 μ 1，注入液相色譜儀，儀器條件：高效液相色譜儀 Agilentl260,蒸發(fā)光散射檢測器Agilent 1260 Infinity ELSD，色譜柱6.5mmX300mm waters sugar pak-1，柱溫70-90°C，流動(dòng)相為100%水，流速為0.5-lml/min，蒸發(fā)光散射檢 測器檢測條件Evaporator Temp:7〇-9CTC，Nebulize;r Temp:7〇-9CTC，Gas Flow Rate:0