一種基于高效液相色譜法檢測(cè)卷煙煙氣所含角鯊烯的樣品液凈化處理方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及卷煙煙氣中成分的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體地，涉及一種高效液相色譜 法檢測(cè)卷煙煙氣所含角鯊烯的樣品液凈化處理方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 角鯊烯最初是從鯊魚(yú)的肝油中發(fā)現(xiàn)的，1914年被命名為Squalene，其化學(xué)名稱(chēng)為 2,6，10，15，19,23-六甲基一2,6，10，14，18,22-二十四碳六烯，屬開(kāi)鏈三萜類(lèi)化合物。
[0003] 角鯊烯具有提高人體內(nèi)超氧化物歧化酶(S0D)活性、增強(qiáng)機(jī)體抗氧化性和免疫能 力、改善性功能、抗衰老、抗疲勞、抗腫瘤等多種生理功能，是一種無(wú)毒性的具有防病治病作 用的生物活性物質(zhì)。最近研究發(fā)現(xiàn)角鯊烯對(duì)人體還具有解毒作用，可移除組織中的脂溶性 毒素。已有研究表明：在煙絲中添加一定量的角鯊烯，可降低煙氣中幾種有害物質(zhì)和自由基 含量，表明角鯊烯具有獨(dú)特降害作用，目前開(kāi)發(fā)利用角鯊烯已成為科技界和煙草業(yè)研究的 熱點(diǎn)。
[0004] 2014年4月，國(guó)家煙草專(zhuān)賣(mài)局下發(fā)關(guān)于加快卷煙降焦減害技術(shù)成果推廣應(yīng)用的通 知（國(guó)煙辦綜[2014]218號(hào)），提出要加大卷煙減害技術(shù)重大專(zhuān)項(xiàng)研究成果的應(yīng)用推廣力度， 要采取針對(duì)性技術(shù)措施加快卷煙降焦減害步伐。為了配合國(guó)家局加快卷煙降焦減害步伐的 重大決策，本申請(qǐng)人在完成中國(guó)煙草總公司2013年度科技面上項(xiàng)目《廣西主流煙氣天然抗 氧化劑角鯊烯的生態(tài)累積與減害研究》（中煙辦[2013] 149號(hào))研究基礎(chǔ)上，迫切需要建立一 種可行的適于標(biāo)準(zhǔn)的主流煙氣角鯊烯含量的檢測(cè)方法。
[0005] 但是，目前國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有可參考的煙氣中尤其是主流煙氣中角鯊烯定性和定量的 檢測(cè)方法，因此，在煙草行業(yè)建立烤煙中角鯊烯定性和定量的檢測(cè)方法具有前瞻性，也是十 分必要的。而在煙氣中角鯊烯的檢測(cè)中，良好的樣品前處理方法對(duì)獲得準(zhǔn)確科學(xué)的檢測(cè)結(jié) 果起到關(guān)鍵性作用。在確定的檢測(cè)條件下，采用不同提取劑提取樣品中角鯊烯，其提取效 率、提取操作用時(shí)等因素都是必須考慮的重要因素，各個(gè)因素之間又是相互影響的關(guān)系，目 前未見(jiàn)基于高效液相色譜法檢測(cè)煙葉中角鯊烯的樣品前處理研究報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是填補(bǔ)現(xiàn)有煙氣中角鯊烯的檢測(cè)技術(shù)不足，尤其是適于 高效液相色譜法檢測(cè)煙氣中角鯊烯的樣品前處理方法的不足，提供一種基于高效液相色譜 法檢測(cè)卷煙煙氣所含角鯊烯的樣品液凈化處理方法。
[0007] 本發(fā)明的技術(shù)方案通過(guò)以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：
[0008] 提供一種基于高效液相色譜法檢測(cè)卷煙煙氣所含角鯊烯的樣品液凈化處理方法， 包括以下步驟：
[0009] S11.收集煙氣固粒相物并提取:抽吸卷煙，采用濾片收集煙氣固粒相物；
[0010] S12.提取:將收集了煙氣固粒相物劍橋?yàn)V片放入錐形瓶中，加入提取劑，常溫下振 蕩提取，得提取液；
[0011] S13.凈化:取步驟S12所得提取液，經(jīng)過(guò)再處理后得到的溶液再經(jīng)過(guò)柱，氯仿洗脫， 收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用色譜乙腈定容，過(guò)〇. 22μπι濾膜即得待測(cè)樣品液；
[0012] 其中，步驟S12所述提取劑為氯仿；
[0013]步驟S13所述再處理指的是將步驟S12所得提取液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干，用正己烷溶解， 再用正己烷洗滌；
[0014]步驟S13所述過(guò)柱是采用硅膠和Ν-丙基乙二胺復(fù)合固相萃取柱。
[0015] 優(yōu)選地，步驟S11所述抽吸卷煙是按照GB/T 16450標(biāo)準(zhǔn)。步驟S11所述濾片為Φ 92mm的劍橋?yàn)V片。
[0016] 優(yōu)選地，步驟S12所述振蕩提取是用搖床以130轉(zhuǎn)/min振蕩20min。
[0017] 優(yōu)選地，步驟S13所述洗滌的次數(shù)為3次。
[0018]優(yōu)選地，步驟S13所述硅膠和N-丙基乙二胺復(fù)合固相萃取柱的裝柱方法為稱(chēng)取 0. lgPSA和0. lg硅膠裝柱，上方加1.0g無(wú)水硫酸鈉。
[0019] 基于所述樣品前處理方法，本發(fā)明同時(shí)提供一種高效液相色譜法檢測(cè)主流煙氣中 所含角鯊烯的方法，以甲醇和乙腈為流動(dòng)相，采用填有粒徑5μπι的高效固定相的柱色譜分離 技術(shù)，精確吸取lOyL待測(cè)樣品液注入高效液相色譜儀進(jìn)行色譜分離，用紫外吸收檢測(cè)器，于 210nm波長(zhǎng)處檢測(cè)角鯊烯的吸收值，采用外標(biāo)法，根據(jù)吸收峰面積計(jì)算其含量。
[0020] 所述高效液相色譜法檢測(cè)主流煙氣中所含角鯊烯的方法包括以下步驟：
[0021] S1.樣品經(jīng)前處理得到樣品液；
[0022] S2.配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)；
[0023] S3.檢測(cè):取樣品液液注入高效液相色譜儀檢測(cè)；
[0024] S4.采用外標(biāo)法，根據(jù)吸收峰面積計(jì)算角鯊烯含量。
[0025] 所述檢測(cè)的檢測(cè)條件為：
[0026] (1)高效液相色譜儀HPLC(AgilentllOO)配紫外檢測(cè)器；
[0027] (2)色譜柱：C18 柱，5ym，4.6X25〇mm;
[0028] ⑶柱溫：20°C;
[0029] (4)流動(dòng)相類(lèi)型：甲醇：乙腈(V:V = 70:30);
[0030] (5)流動(dòng)相流速:0.8mL/min;
[0031] (6)檢測(cè)波長(zhǎng)為：210nm;
[0032] (7)進(jìn)樣量：10yL。
[0033] 步驟S2所述配制標(biāo)準(zhǔn)溶液的方法是準(zhǔn)確稱(chēng)取0. lg角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，精確至O.OOOlg， 用乙腈(色譜純)溶解后定容至100mL配制成1000mg/L的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分振蕩搖勻。所 配標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4°C保存，待用。
[0034] 步驟S2所述角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的建立的方法是:采用系列稀釋法，分別配制成濃度 為0.002，0.01，0.05，0.2，0.5mg/mL的角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液于高效液相色譜進(jìn)樣檢測(cè)；以進(jìn)樣濃 度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，求出角鯊烯濃度與相應(yīng)峰面積的線(xiàn)性回歸方 程。
[0035] 本發(fā)明適用于卷煙主流煙氣中角鯊烯的檢測(cè)。
[0036]本發(fā)明具有以下有益效果：
[0037]本發(fā)明針對(duì)卷煙煙氣建立了一種適于高效液相色譜法檢測(cè)煙葉中角鯊烯的樣品 前處理方法，采用氯仿作為提取溶劑，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后用正己烷溶解和洗滌，保障了較高的 提取效率。再經(jīng)硅膠和N-丙基乙二胺復(fù)合固相萃取柱科學(xué)凈化，很好地去除雜質(zhì)?；谒?樣品前處理方法，可建立煙氣中角鯊烯的高效液相色譜檢測(cè)方法，色譜峰分離較好，具有準(zhǔn) 確、快速、高靈敏、重現(xiàn)性好、回收率高等優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說(shuō)明】
[0038] 圖1角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。
[0039]圖2角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（lmg/L角鯊烯標(biāo)樣，峰面積= 41.9)。
[0040] 圖3角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)樣品色譜圖（5mg/L角鯊烯標(biāo)樣，峰面積= 213.3)。
[0041] 圖4氯仿提取液未添加角鯊烯空白樣品色譜圖。
[0042]圖5氯仿提取液添加40mg/kg(換算為煙絲含量)角鯊烯樣品色譜圖。
[0043]圖6未經(jīng)凈化處理效果色譜圖（空白對(duì)照）。
[0044]圖7未經(jīng)凈化處理效果色譜圖（添加40mg/kg角鯊烯樣品）。
[0045] 圖8用PSA和硅膠復(fù)合柱凈化后樣品的色譜圖（空白對(duì)照）。
[0046] 圖9用PSA和硅膠復(fù)合柱凈化后樣品的色譜圖（添加40mg/kg角鯊烯樣品）。
[0047]圖10氯仿提取液直接過(guò)柱處理后色譜圖。
[0048]圖11氯仿提取液再經(jīng)正己烷溶解后過(guò)柱處理后色譜圖。
[0049]圖12 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，5mg/kg角鯊烯標(biāo)樣）。
[0050] 圖13 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，空白對(duì)照）。
[0051] 圖14 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，添加40mg/kg角鯊烯的樣品）。 [0052]圖15 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相乙腈:水，5mg/kg角鯊烯標(biāo)樣）。
[0053]圖16 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相乙腈:水，空白對(duì)照）。
[0054]圖17 C8柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相乙腈:水，添加40mg/kg角鯊烯的樣品）。
[0055]圖18 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，75:25，流速1. OmL/min，柱溫30 °C，波長(zhǎng)210nm，5mg/kg角藍(lán)稀標(biāo)樣）。
[0056] 圖19 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，75:25，流速1. OmL/min，柱溫30 。(：，波長(zhǎng)210nm，空白對(duì)照）。
[0057]圖20 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，75:25，流速1. OmL/min，柱溫30 °C，波長(zhǎng)210nm，添加40mg/kg角藍(lán)稀的樣品）。
[0058] 圖21 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相甲醇：乙腈，70:30，流速0.8mL/min，柱溫20 。(：，波長(zhǎng)210nm，空白對(duì)照）。
[0059]圖22 C18柱檢測(cè)樣品的色譜圖（流動(dòng)相流動(dòng)相甲醇：乙腈，70:30，流速0.8mL/min， 柱溫20°C，波長(zhǎng)210nm，添加40mg/kg角藍(lán)稀的樣品）。
【具體實(shí)施方式】
[0060]下面結(jié)合附圖和具體實(shí)施例進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明方法。下述實(shí)施例和附圖僅用于示 例性說(shuō)明，不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。除非特別說(shuō)明，下述實(shí)施例中使用的試劑原料為常 規(guī)市購(gòu)或商業(yè)途徑獲得的試劑原料，除非特別說(shuō)明，下述實(shí)施例中使用的方法和設(shè)備為本 領(lǐng)域常規(guī)使用的方法和設(shè)備。為方便說(shuō)明，本發(fā)明實(shí)施例中使用的儀器和試劑說(shuō)明如下，但 并不因此限定本發(fā)明。
[0061]儀器：
[0062] (1)高效液相色譜儀HPLC(AgilentllOO)，配備:脫氣栗、四元栗、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫 箱和紫外檢測(cè)器(美國(guó)Agilent公司）
[0063] (2)全溫控?fù)u床(江蘇金壇市榮華儀器有限公司）
[0064] (3)電子天平(BSA2245，d = 0.1mg，賽多利斯科學(xué)儀器有限公司）
[0065] (4)旋轉(zhuǎn)真空蒸發(fā)器:ZFQ-3型(上海亞榮生化儀器廠(chǎng)）
[0066] (5)真空抽濾栗:SHZ-Dm型(鞏義市予華儀器廠(chǎng)）
[0067] (6)IICA?：MS3basic渦旋儀(MS：3BS25，IKA)
[0068] (7)RM2〇OA 吸煙機(jī)（德國(guó)）
[0069] (8)固相萃取柱(varian)
[0070] (9)各種實(shí)驗(yàn)室通用玻璃器皿
[0071] 試劑：
[0072] (1)99.8%角鯊烯對(duì)照品（中國(guó)藥檢所）
[0073] (2)甲醇(色譜純）
[0074] (3)乙腈(色譜純）
[0075] (4)正己烷(分析純）
[0076] (5)三氯甲烷(氯仿，分析純）
[0077] (6)石油醚(分析純）
[0078] (7)0·22μπι 有機(jī)濾膜
[0079] (8)凈化劑:PSA(Welchrom)，硅膠(200-300目，青島海洋化工廠(chǎng)）
[0080] (9)商品煙(從廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司產(chǎn)品中隨機(jī)性抽?。?br>[0081 ] 實(shí)施例1
[0082] 1.角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制
[0083] 準(zhǔn)確稱(chēng)取O.lg角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)品，精確至O.OOOlg，用乙腈（色譜純）溶解后定容至 100mL配制成1000mg/L角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)溶液，充分振蕩搖勻。所配標(biāo)準(zhǔn)溶液置于4°C保存。
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