草木犀藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及本發(fā)明涉及中藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，尤其是草木犀藥材高效液相 色譜（HPLC)指紋圖譜的構(gòu)建方法及其標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。本發(fā)明屬于藥物分析技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 中藥指紋圖譜特指中藥樣本經(jīng)光譜或色譜等現(xiàn)代分析技術(shù)得到的中藥各組分群 體特征的圖譜或圖像。中藥指紋圖譜作為一種綜合的、可量化的質(zhì)量控制手段，可提供比單 一指標(biāo)成分更全面的信息。目前，美國FDA、英國草藥典、印度草藥典、德國藥用植物學(xué)會、加 拿大藥用植物協(xié)會等均接受指紋圖譜的指控方法，中國藥品監(jiān)督管理局也頒發(fā)了《中藥注 射劑指紋圖譜研究的技術(shù)要求（暫行）》。中藥材、中成藥指紋圖譜技術(shù)已經(jīng)成為牽動行業(yè) 全面進(jìn)步、帶動中藥現(xiàn)代化、推動中藥走向世界的關(guān)鍵技術(shù)之一。
[0003] 草木犀，又寫作草木樨,為豆科植物草木犀屬（Melilotus Mill.) -年生或二年生 草本。以全草入藥，生于沙丘、山坡、草原、海邊，分布于我國大部分省區(qū)，又名辟漢草、省頭 草、野苜蓿及鐵掃把，目前栽培的多為白花草木犀和黃花草木犀。黃花草木犀由于其自身的 生長優(yōu)勢和化學(xué)成分適宜，在中國被用作很好的香料原料。民間以葉、花制成軟膏，用作外 用藥，或煎服用于治療浮腫、腹痛、瘧疾等證。
[0004] 本專利中提供了一種草木犀藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，該方法簡單、快速、有效。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種草木犀藥材指紋圖譜的構(gòu)建方法，以及由此方法得到的草木犀標(biāo) 準(zhǔn)指紋圖譜。所述方法前處理比較簡單，并且獲得的指紋圖譜出峰數(shù)目多，各峰分離度較 好，在線分析時間短，構(gòu)成了草木犀藥材的指紋特征，可作為草木犀藥材的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜。
[0006] 本發(fā)明的草木犀藥材高效液相色譜指紋圖譜的構(gòu)建方法，包括如下步驟：
[0007] 1)稱取草木犀藥材粉末，加入體積百分濃度為30~70%的甲醇水溶液，超聲震蕩 提取，將提取液過濾得到濾液，即得到待測溶液；
[0008] 2)將步驟1)獲得的待測溶液進(jìn)行高效液相色譜分析，用十八烷基硅烷鍵合硅膠 為填充劑；以乙腈為流動相A，以質(zhì)量百分濃度為0. 05~0. 2 %磷酸水溶液為流動相B，進(jìn) 行線性梯度洗脫得到草木犀藥材的指紋圖譜，其中，流速為〇. 8~1. 2ml/min ;
[0009] 檢測波長為275nm。
[0010] 所述方法中，所述步驟2)中梯度洗脫程序以如下體積比濃度配置進(jìn)行：
[0011]
[0012] ，即所述步驟2)中梯度洗脫程序如下：
[0013] 梯度1 :第0_5min進(jìn)行等度洗脫，流動相A的體積百分濃度為3~10%，流動相B 的體積百分濃度為97~90% ;
[0014] 梯度2 :第5-45min進(jìn)行線性梯度洗脫，流動相A的體積百分濃度由3~10%線性 增至22~25%，流動相B的體積百分濃度由97~90 %線性降至78~75% ;
[0015] 梯度3 :第45-60min進(jìn)行線性梯度洗脫，流動相A的體積百分濃度由22~25%線 性降至3~10%，流動相B的體積百分濃度由78~75 %線性升至97~90%。
[0016] 在本發(fā)明一個技術(shù)方案中，所述步驟2)中梯度洗脫程序以如下體積比濃度配置 進(jìn)行：
[0017]
[0018] ，即所述步驟2)中梯度洗脫程序如下：
[0019] 梯度1 :第0_5min進(jìn)行等度洗脫，流動相A的體積百分濃度為3%，流動相B的體 積百分濃度為97% ;
[0020] 梯度2 :第5-45min進(jìn)行線性梯度洗脫，流動相A的體積百分濃度由3%線性增至 22%，流動相B的體積百分濃度由97 %線性降至78% ;
[0021] 梯度3 :第45-60min進(jìn)行線性梯度洗脫，流動相A的體積百分濃度由22%線性降 至3 %，流動相B的體積百分濃度由78 %線性升至97 %。
[0022] 所述方法中，所述步驟2)中十八烷基硅烷鍵合硅膠為YMC J'sphere 0DS-M80、 YMC-Pack 0DS-A或Agilent Eclipse Plus C18;流動相B為質(zhì)量百分濃度為0.1 %的磷酸 水溶液；流速為1. 〇ml/min。
[0023] 在本發(fā)明一個技術(shù)方案中，所述步驟2)中所述高效液相色譜分析的柱溫25~ 45°C，優(yōu)選為 30°C。
[0024] 在本發(fā)明一個技術(shù)方案中，所述方法還包括配制香豆素對照品溶液，并將其進(jìn)行 高效液相色譜分析，然后以香豆素對照品溶液的指紋圖譜為參照，以香豆素峰為參照，根據(jù) 相對保留時間標(biāo)定供試品溶液的指紋特征的步驟。
[0025] 在本發(fā)明一個技術(shù)方案中，所述步驟1)中，所述超聲振蕩的時間為30~40min，優(yōu) 選為30min。
[0026] 在本發(fā)明一個技術(shù)方案中，所述步驟1)中，還包括將濾渣重復(fù)添加體積百分濃度 為30~70%的甲醇水溶液，超聲震蕩提取，過濾，將濾液合并，并定容至250ml，作為待測溶 液；其中，所述草木樨藥材粉末或者濾渣與體積百分濃度為30~70%的甲醇水溶液的添加 比例為2g :80~100ml。
[0027] 在本發(fā)明一個技術(shù)方案中，所述步驟1)中，所述甲醇水溶液的體積百分濃度為 50%，所述草木樨藥材粉末或者濾渣與甲醇水溶液的添加比例為2g :90ml。
[0028] 在本發(fā)明一個技術(shù)方案中，所述步驟1)中，所述過濾為用孔徑為0. 45um的濾膜過 濾。
[0029] 在本發(fā)明的一個技術(shù)方案中，所述步驟2)中，高效液相色譜的進(jìn)樣量為20 μ 1。
[0030] 通過上述方法，本發(fā)明獲得了草木樨藥材的高效液相色譜指紋圖譜。
[0031 ] 在本發(fā)明的中，所述HPLC指紋圖譜，可以為下述指紋圖譜：由29個共有特征峰組 成，特征峰的保留時間分別為：峰1 :3. 2min、峰2 :3. 5min、峰3 :4. 9min、峰4 :6. 2min、峰5 : 6. 6min、峰 6 :13. lmin、峰 7 :13. 7min、峰 8 :15. lmin、峰 9 :15. 6min、峰 10 :20. 7min、峰 11 : 24. Omin、峰 12 :30. 3min、峰 13 :31. lmin、峰 14 :32. 4min、峰 15 :32. 8min、峰 16 :33. 7min、 峰 17:34. 3min、峰 18 :34. 8min、峰 19 :35. 8min、峰 20 :36. 8min、峰 21 :37. 7min、峰 22 : 38. 6min、峰 23 :39. 4min、峰 24 :40.0 min、峰 25 :41. 9min、峰 26 :44. Omin、峰 27 :46. 4min、 峰 28 :48. lmin、峰 29 :50. 3min。
[0032] 以29號峰香豆素為參照峰，特征峰的相對保留時間分別為：峰1 :0. 063 (±5% )、 峰 2 :0· 069(±5 % )、峰 3 :0· 097(±5 % )、峰 4 :0· 122(±5 % )、峰 5 :0· 131(±5 % )、峰 6 :0.261(±5% )、峰 7 :0.273(±5% )、峰 8 :0.300(±5% )、峰 9 :0.311(±5% )、峰 10 : 0.411 (±5% )、峰 11 :0.476 (±5% )、峰 12 :0.602 (±5% )、峰 13 :0.618 (±5% )、峰 14 : 0.644(±5% )、峰 15 :0.652(±5% )、峰 16 :0.671(±5% )、峰 17 :0.681(±5% )、峰 18 : 0.691 (±5% )、峰 19 :0.713 (±5% )、峰 20 :0.732 (±5% )、峰 21 :0.749 (±5% )、峰 22 : 0· 768(±5% )、峰 23 :0· 783(±5% )、峰 24 :0· 795(±5% )、峰 25 :0· 833(±5% )、峰 26 : 0· 875(±5% )、峰 27 :0· 923(±5% )、峰 28 :0· 957(±5% )、峰 29 :1· 000。
[0033] 在本發(fā)明的又一個實施方式中，所述HPLC指紋圖譜，可以為下述指紋圖譜：由 32個共有特征峰組成，其保留時間分別為：峰1 :3. 6min、峰2 :3. 9min、峰3 :5. 5min、峰4 : 6. 9min、峰 5 :7. 4min、峰 6 :14. 2min、峰 7 :14. 9min、峰 8 :16. 4min、峰 9 :17. Omin、峰 10 : 21. 4min、峰 11 :22. 3min、峰 12 :22. 7min、峰 13 :26. Omin、峰 14 :27. 4min、峰 15 :29. 3min、 峰 16 :32. 4min、峰 17 :32. 8min、峰 18 :34. 2min、峰 19 :34. 6min、峰 20 :35. 6min、峰 21 : 36. 5min、峰 22 :37. 7min、峰 23 :38. 7min、峰 24 :39. 5min、峰 25 :40. 5min、峰 26 :41. 3min、 峰 27 :41. 8min、峰 28 :44. 8min、峰 29 :45. 8min、峰 30 :48. 4min、峰 31 :51. Omin、峰 32 : 53. 9min〇
[0034] 以32號峰香豆素為參照峰，特征峰的相對保留時間分別為：峰1 :0. 066 (±5% )、 峰 2 :0· 073(±5 % )、峰 3 :0· 102(±5 % )、峰 4