從患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中檢測(cè)自身抗體的方法、肽和檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利說明】從患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中檢測(cè)自身抗體的方法、肽和 檢測(cè)試劑盒
[0001]本申請(qǐng)是申請(qǐng)日為2002年12月11日、發(fā)明名稱為"從患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者 中檢測(cè)自身抗體的方法、肽和檢測(cè)試劑盒"的中國發(fā)明專利申請(qǐng)No. 02824647.0的分案申 請(qǐng)。
技術(shù)領(lǐng)域
[0002] 本發(fā)明涉及一種通過使用包含瓜氨酸殘基或其類似物的肽來從患有類風(fēng)濕性關(guān) 節(jié)炎的患者中檢測(cè)自身抗體的方法。
【背景技術(shù)】
[0003] 該方法由國際專利申請(qǐng)PCT/NL97/00624已知。該文獻(xiàn)中描述了來源于絲聚蛋白 的，包含瓜氨酸或其類似物的肽用于從患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者中檢測(cè)自身抗體的應(yīng) 用。因此，所用的肽適于診斷應(yīng)用，并且與當(dāng)時(shí)采用的方法相比，使更可靠的檢測(cè)成為可能。 更特別的，該方法能降低假陽性率，也就是具有更高的特異性。此外，其敏感性也相對(duì)較高。 一種被稱為cfcl的肽，被36%的來自患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的血清識(shí)別。該肽的環(huán)狀 變異體表現(xiàn)出被更好地識(shí)別(63 % )。
[0004] 前言所述的方法還由國際專利申請(qǐng)PCT/FR00/01857已知。該文獻(xiàn)中描述了來源于 纖維蛋白或纖維蛋白原的，包含瓜氨酸或其類似物的肽用于從患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者 中檢測(cè)自身抗體的應(yīng)用。
[0005] PCT/EP98/07714中描述了來源于絲聚蛋白（原）的合成肽在診斷類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎 中的應(yīng)用。該申請(qǐng)中還記載了來源于人波形纖維蛋白，細(xì)胞角蛋白1，細(xì)胞角蛋白9以及其他 中間纖絲蛋白的合成肽。
[0006] 然而，上述提到的方法仍只能從全部類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者中檢測(cè)出有限數(shù)目的患 者。因此，強(qiáng)烈需要一種可實(shí)現(xiàn)敏感性增加而同時(shí)保持實(shí)質(zhì)上相等或甚至提高的特異性的 方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 為了達(dá)到該目的，本發(fā)明提供了一種如前言所述的方法，該方法的特征在于所述 的自身抗體與含有XG基序的肽單元和含有XnonG基序的肽單元接觸，其中X為瓜氨酸殘基或 其類似物，G為甘氨酸，而nonG為除甘氨酸以外的氨基酸。
[0008] 下述實(shí)驗(yàn)顯示，獲自患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的血清中含有兩種不同的抗體 群。其中一群抗體與諸如上文提到的已出版文獻(xiàn)中公開的XG肽單元反應(yīng)。該群抗體可通過 已公開的XG肽單元部分地檢測(cè)到，當(dāng)采用本發(fā)明所述的肽單元時(shí)，則能檢測(cè)到更大部分的 該群抗體。另一群抗體與XnonG肽單元反應(yīng)。直到目前為止，在已出版的文獻(xiàn)中還沒有觀察 到這群抗體。如下文更詳細(xì)的記載，來自于患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的大多數(shù)血清都含有 這兩群抗體。因此，這些血清可以通過包括XG或XnonG肽單元的診斷測(cè)試來檢測(cè)。然而看來 似乎相當(dāng)大一部分患有類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的患者的血清只含有兩群抗體中的一種。因此，采 用上述已出版公開的文獻(xiàn)中描述的診斷測(cè)試，無法檢測(cè)或僅能檢測(cè)極小一部分的僅含有對(duì) XnonG肽單元的抗體的血清。如今，如果診斷測(cè)試中包括XnonG肽單元，貝lj可以檢測(cè)大部分的 這類血清。因而本發(fā)明所述的改進(jìn)診斷方法包括至少一種XG和一種XnonG肽。因此與已出版 公開文獻(xiàn)中記載的測(cè)試相比，本發(fā)明所述的診斷測(cè)試可達(dá)到20%更為敏感。
[0009]當(dāng)所述的具有XnonG基序的肽單元包括一非來源于天然蛋白如人類絲聚蛋白 (原），纖維蛋白，或纖維蛋白原，以及相關(guān)的蛋白波形纖維蛋白，及細(xì)胞角蛋白1和細(xì)胞角蛋 白9,或其他相關(guān)的中間纖絲蛋白的部分時(shí)，可以獲得特別好的結(jié)果。
[0010]令人驚奇的是，結(jié)果顯示，當(dāng)將該非來源于天然蛋白的XnonG肽與本發(fā)明所述的XG 肽組合時(shí)，可得到一更加改進(jìn)的診斷方法。更特別的，這種肽單元組合在本發(fā)明所述的方法 中的應(yīng)用提供了一種敏感性非常高，且保持優(yōu)異的特異性的診斷方法。由于上述提到的公 開文獻(xiàn)仍然是基于下述觀念，即來自于RA患者的自身抗體與來源于天然存在的蛋白，例如 絲聚蛋白（原），纖維蛋白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細(xì)胞角蛋白1或細(xì)胞角蛋白9的肽特 別好地發(fā)生反應(yīng)，因此這就更讓人驚訝了。例如，PCT/EP98/07714中記載了一種絲聚蛋白來 源的XnonG肽（IPG1249)。它與3.3%的SLE患者血清交叉反應(yīng)，且與絲聚蛋白有82%的同源 性。
[0011]當(dāng)所述的具有XnonG基序的肽單元包含一種三肽時(shí)，則可獲得較好的結(jié)果，其中三 肽的中間氨基酸為瓜氨酸或其類似物，其優(yōu)選選自XXK，XXY，KXI，MXR，RXY，WXK，MXH，VXK， NXR，WXS，RXW，YXM，IXX，XXF，RXH，TXV，PXH，AXF，F(xiàn)XR，YXF，LXM，LXY，YXP，HXS和PXW。
[0012] 優(yōu)選的，nonG為選自!1，1，1，5，1?，1(，￥^，^，(：^或其類似物的氨基酸。如下述實(shí) 驗(yàn)所示，這類XnonG肽單元非常有效。
[0013] 包括XG基序的肽單元，可來源于或不來源于絲聚蛋白（原），纖維蛋白，纖維蛋白 原，波形纖維蛋白，細(xì)胞角蛋白1或細(xì)胞角蛋白9,并且有效地是由PCT/NL97/00624中已知的 cfcl 〇
[0014] 在本文的上下文中，術(shù)語氨基酸包括天然的和非天然的氨基酸，和具有D-構(gòu)型或 L-構(gòu)型的氨基酸。
[0015] 在本申請(qǐng)中，非天然氨基酸應(yīng)理解為該類的氨基酸存在于反一倒位肽，反向肽，其 中側(cè)鏈位于肽骨架的酰胺氮原子上的肽，和其中肽骨架上的C0被2,3或優(yōu)選單一-CH 2-基團(tuán) 所替代的肽(假肽）中。
[0016] 氨基酸還可被修飾。例如，羧酸基團(tuán)可以被酯化或可被轉(zhuǎn)化為酰胺，同時(shí)氨基基團(tuán) 可被烷基化，例如，甲基化?？蛇x的，肽上的功能基團(tuán)可以提供有保護(hù)基團(tuán)或標(biāo)記(例如熒光 或放射性標(biāo)記）。肽中的氨基基團(tuán)和羧酸基團(tuán)可以以通過使用酸或堿而形成的鹽的形式存 在。如果采用合成肽，則很容易制備可以使用的本發(fā)明范圍內(nèi)的所有種類的變異體。例如， 芳族側(cè)鏈基團(tuán)，如來源于苯丙氨酸和酪氨酸，可被一個(gè)或多個(gè)鹵素原子鹵化。肽模擬 (peptidomimetic)和有機(jī)模擬(organomimetic)的實(shí)施方案也落在本發(fā)明的范圍內(nèi)，及其 在本發(fā)明所述方法中的應(yīng)用。還可采用其類似物來代替Cit殘基，例如那些在圖1中列出的 氨基酸形式的類似物。這種類似物及其制備方法為本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員所公知。例如， Sonke et al.在 Stereoselective Biocatalysis(2000)，pp.23_58 中有記載，以及在 Greene:Protective groups in Organic synthesis(ffiley,New York 1999)中。
[0017]依照有利的實(shí)施方案，所述的瓜氨酸類似物的側(cè)鏈具有如下通式(I):
[0019] 其中
[0020] Q = NH2，CH3，NHCH3SN(CH3)2;
[0021] Y = 〇，NH，或 NCH3;
[0022] 2 = 0，順或〇12;和
[0023] n = 2,3或 4;
[0024] 條件是如果Q = NH2和Z = NH，則Y不為NH。
[0025] 在本文上下文中，肽單元應(yīng)理解為長度至少7個(gè)氨基酸的肽。肽單元可以具有一個(gè) 或多個(gè)側(cè)鏈。同時(shí)，肽單元或肽單元的末端可以彼此相互獨(dú)立地被乙?；腔?，烷基化， 或磷酸化。
[0026] 本文上下文中所述的肽單元是指非來源于絲聚蛋白（原），纖維蛋白，纖維蛋白原， 波形纖維蛋白，細(xì)胞角蛋白1或細(xì)胞角蛋白9,和其他中間纖絲蛋白，如果與這些蛋白的同源 性(氨基酸序列的相似性)低于80%，更優(yōu)選的低于75%，如低于70%或65%，最優(yōu)選的低于 60%，例如低于55%或50%。所述的肽單元列于表5中，其非來源于絲聚蛋白（原），纖維蛋 白，纖維蛋白原，波形纖維蛋白，細(xì)胞角蛋白1和細(xì)胞角蛋白9,且同源性介于15 - 45%。關(guān)于 同源性檢查，精氨酸、瓜氨酸和瓜氨酸類似物被認(rèn)為是等同的（同一的）。
[0027]包括XG和XnonG的肽單元可以是或不是相同分子的一部分。隨后將對(duì)此進(jìn)行敘述。 為了進(jìn)行檢測(cè)試驗(yàn)，所述的肽單元可以與一載體相連，并可選地提供有標(biāo)記。得到的復(fù)合物 可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員公知的任何方式檢測(cè)。所述的復(fù)合物可以間接檢測(cè)，例如在 競(jìng)爭試驗(yàn)的情況下，其中復(fù)合物本身不標(biāo)記。與兩個(gè)肽單元的反應(yīng)可以同時(shí)或相繼地并在 相同容器(例如微量滴定板的孔)或不同容器中發(fā)生。
[0028] 本申請(qǐng)不旨在作為教導(dǎo)如何成為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的教育出版物。因此，本申 請(qǐng)僅限于提供了使本領(lǐng)域普通技術(shù)人員能夠理解發(fā)明，實(shí)施發(fā)明和理解本發(fā)明要求保護(hù)的 范圍的充分信息。
[0029] 優(yōu)選的，所述的肽單元被確認(rèn)患有RA的患者的100份隨機(jī)血清中的至少2份所識(shí) 另IJ。很明顯，優(yōu)選采用能被顯著更高百分比的，優(yōu)選至少30%的血清識(shí)別的肽單元。本發(fā)明 所述方法中的肽單元的數(shù)目優(yōu)選為2或大于2。
[0030] 優(yōu)選的，本發(fā)明涉及上述的一種方法，其中具有XG基序的肽單元和具有XnonG基序 的肽單元被至少10%的患者系列血清同時(shí)識(shí)別。毫無疑問，優(yōu)選那些導(dǎo)致更高敏感性的肽 單元組合。采用本文所述的一些肽單元組合，診斷測(cè)試可以獲得40,60,70,80或甚至85和高 于90 %的敏感性。
[0031] 已顯示，如果其中的至少一種肽單元為環(huán)狀肽單元，則檢測(cè)的敏感性可以進(jìn)一步 提尚。
[0032] 具有XG基序的肽單元和具有XnonG的肽單元優(yōu)選為多肽(multipeptide)的一部 分。根據(jù)本發(fā)明的上下文，多肽為包括至少2個(gè)抗原性肽單元的分子，也就是，可以或可以不 通過共價(jià)鍵連接的肽單元的組合。這種多肽可以由線性的，分枝狀的，環(huán)狀的肽單元或這些 的組合來組成。多肽既可以由具有相同氨基酸序列的肽單元組成，也可由具有不同氨基酸 序列的肽單元組成。根據(jù)本發(fā)明所述的多肽包括至少7個(gè)，優(yōu)選至少10個(gè)氨基酸，也就是所 述的肽單元可以重疊。理所當(dāng)然的，XG和XnonG基序不能重疊。
[0033]本發(fā)明還涉及對(duì)于本發(fā)明所述方法非常有用的XnonG肽單元，其包括具有如下通 式(Π)的序列：
[0034] (Al-A2-A3-A4-A5)-Cit-(A6)-(A7-A8-A9-A10-All)(II)
[0035] 其中，A1-A2-A3-A4-A5為選自下述的氨基酸序列
[0036] -RHGRQ
[0037] -IRCitYK
[0038] -HGRQCit
[0039] -GRQCitCit
[0040] -FQMCitH
[0041] -CitffRGM
[0042] -ARFQM
[0043] -QCitYKff
[0044] -KPYTV
[0045] -RNLRL
[0046] -RRRCitY
[0047] -RFKSN
[0048] -RGKSN
[0049] -RffVSQ
[0050] -MKPRY [0051 ] -KSFVff
[0052] -YSFVff
[0053] -FQMRH
[0054] -RNMNR
[0055] -RMGRP
[0056] 及其同源序列；
[0057] A7為除甘氨酸之外的氨基酸；
[0058] A7-A8-A9-A10-A11為選自下述的氨基酸序列
[0059] -KYIIY
[0060] -TNRKF
[0061] -KffCitKI
[0062] -CitRAVI
[0063] -RCitGHS
[0064] -CitGRSR
[0065] -CitYIIY
[0066] -CitRLIR
[0067] -IERKR
[0068] -FMRKP
[0069] -FMRRP
[0070] -ERNHA [0071 ] -AVITA
[0072] -TPNRff
[0073] -TYNRff
[0074] -RTPTR
[0075] -RIVVV
[007