紅細(xì)胞、B型磁化紅細(xì)胞、0型磁化紅細(xì)胞50ul;
[0215] (4)混勻，室溫反應(yīng)lmin;
[0216] (5)磁鐵吸附，振蕩試管并判定結(jié)果，若磁化紅細(xì)胞發(fā)生凝集，則為陽(yáng)性反應(yīng);反 之，若磁化紅細(xì)胞不發(fā)生凝集，則為陰性反應(yīng)。反應(yīng)格局判定標(biāo)準(zhǔn)如下：
[0217]
[0218] 2.紅細(xì)胞不規(guī)則抗體檢測(cè)
[0219] 用已知血型的覆蓋我國(guó)臨床有意義紅細(xì)胞抗原的多人份0型紅細(xì)胞按上述具體實(shí) 施方式制備成磁化紅細(xì)胞，以替代新鮮紅細(xì)胞進(jìn)行紅細(xì)胞不規(guī)則抗體檢測(cè)。
[0220] 檢測(cè)步驟如下：
[0221] (1)取潔凈試管，做好標(biāo)記；
[0222] (2)加入待檢樣本(血清或血漿)50ul;
[0223] (3)加入上述磁化紅細(xì)胞50ul;
[0224] (4)混勻，室溫反應(yīng)lmin;
[0225] (5)磁鐵吸附，振蕩試管并判定結(jié)果，若磁化紅細(xì)胞發(fā)生凝集（陽(yáng)性反應(yīng)），表明待 檢樣本中含有與該紅細(xì)胞抗原相對(duì)應(yīng)的抗體，反之，若磁化紅細(xì)胞不發(fā)生凝集(陰性反應(yīng)）， 表明待檢樣本中不含與紅細(xì)胞抗原對(duì)應(yīng)的抗體。
[0226] 3.交叉配血
[0227] 用鮮血員紅細(xì)胞按上述【具體實(shí)施方式】制備成磁化紅細(xì)胞，以替代新鮮紅細(xì)胞進(jìn)行 交叉配血。
[0228] 檢測(cè)步驟如下：
[0229] (1)取潔凈試管，做好標(biāo)記；
[0230] (2)加入受血者(血清或血漿)50ul;
[0231] (3)加入鮮血員磁化紅細(xì)胞50ul;
[0232] (4)混勻，室溫反應(yīng)lmin;
[0233] (5)磁鐵吸附，振蕩試管并判定結(jié)果，若磁化紅細(xì)胞發(fā)生凝集（陽(yáng)性反應(yīng)），表明待 檢樣本中含有與該紅細(xì)胞抗原相對(duì)應(yīng)的抗體，配型不合;反之，若磁化紅細(xì)胞不發(fā)生凝集 (陰性反應(yīng)），表明待檢樣本中不含與紅細(xì)胞抗原對(duì)應(yīng)的抗體配型相合。
[0234] 試驗(yàn)例2細(xì)菌磁顆粒負(fù)載抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆抗體效果試驗(yàn)
[0235] 選擇不同的偶聯(lián)劑，其余的方法按照實(shí)施例13的方法制備超順磁性功能顆粒，細(xì) 菌磁顆粒對(duì)抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆抗體的負(fù)載效果見(jiàn)表1;
[0236] 表1不同偶聯(lián)劑對(duì)負(fù)載效果的影響r>[0237]
[0238] 選擇不同的孵育劑，其余的方法按照實(shí)施例14的方法制備超順磁性功能顆粒，細(xì) 菌磁顆粒對(duì)抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆抗體的負(fù)載效果見(jiàn)表2;
[0239] 表2不同孵育劑對(duì)負(fù)載效果的影響
[0240]
[0241] 從表1中可看出，通過(guò)選擇4中不同的偶聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)，抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆 抗體的負(fù)載量可達(dá)到783yg/mg，當(dāng)采用2或3種偶聯(lián)劑進(jìn)行混合，或者采用本發(fā)明之外的偶 聯(lián)劑進(jìn)行偶聯(lián)，細(xì)菌磁顆粒負(fù)載的抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆抗體的量均顯著降低;從表2 中可以看出，當(dāng)選擇不同殼聚糖和海藻酸鈉混合孵育劑時(shí)，可提高細(xì)菌磁顆粒對(duì)抗紅細(xì)胞 糖蛋白GPA單克隆抗體的負(fù)載量。
[0242] 選擇不同的處理?xiàng)l件，偶聯(lián)劑選自質(zhì)量比為1:1.2:1:2.5的EDC、NHS、瓊脂和無(wú)水 硫酸鈣的混合物，孵育劑選自質(zhì)量比為2:7.2的殼聚糖和海藻酸鈉的混合物，其余的步驟按 照實(shí)施例14的方法制備超順磁性功能顆粒，細(xì)菌磁顆粒對(duì)抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆抗體 的負(fù)載效果見(jiàn)表3;
[0243] 表3不同處理步驟對(duì)負(fù)載效果的影響
[0244]
[0245] 從表3中可知，細(xì)菌磁顆粒的處理步驟對(duì)細(xì)菌磁顆粒對(duì)抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆 抗體的負(fù)載效果具有很大的影響。
[0246] 試驗(yàn)例3趨磁細(xì)菌MSR-1菌株擴(kuò)大培養(yǎng)情況
[0247] 1)分組
[0248] 試驗(yàn)1組:本發(fā)明實(shí)施例20所述的制備方法；
[0249] 對(duì)照1組:對(duì)照例1的制備方法；
[0250]對(duì)照2組:對(duì)照例2的制備方法；
[0251]對(duì)照3組:CN1952112公開(kāi)的一種兼性厭氧趨磁細(xì)菌及其分離、純培養(yǎng)方法和細(xì)菌 磁顆粒的提取、純化方法中公開(kāi)的培養(yǎng)方法；
[0252] 2)采用臺(tái)盼藍(lán)經(jīng)典染色法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，接種時(shí)細(xì)胞為IX 104個(gè)/ml，分別統(tǒng)計(jì) 原代細(xì)胞和擴(kuò)大培養(yǎng)后的數(shù)量，結(jié)果見(jiàn)表4。
[0253]表4各組趨磁細(xì)菌MSR-1菌株體外培養(yǎng)擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)果
[0254]
[0255] 由表中可以看出，本發(fā)明提供的趨磁細(xì)菌培養(yǎng)方法可以有效的體外培養(yǎng)趨磁細(xì)菌 MSR_1菌株。
[0256] 以上所述僅為本發(fā)明的實(shí)施例，并非因此限制本發(fā)明的專(zhuān)利范圍，凡是利用本發(fā) 明說(shuō)明書(shū)內(nèi)容所作的等效結(jié)構(gòu)或等效流程變換，或直接或間接運(yùn)用在其它相關(guān)的技術(shù)領(lǐng) 域，均同理包括在本發(fā)明的專(zhuān)利保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種超順磁性功能顆粒，其特征在于，所述顆粒是由表面基團(tuán)通過(guò)偶聯(lián)劑活化后的 細(xì)菌磁顆粒和抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆抗體孵育而成。2. 如權(quán)利要求1所述的超順磁性功能顆粒，其特征在于，所述偶聯(lián)劑為質(zhì)量比為1:1-1.2的EDC和NHS的混合物。3. 如權(quán)利要求1所述的超順磁性功能顆粒，其特征在于，所述孵育中加入重量份數(shù)比為 2:5.5-7.2的殼聚糖和海藻酸鈉的混合物作為孵育劑。4. 一種磁化紅細(xì)胞，其特征在于，所述磁化紅細(xì)胞是由權(quán)利要求1-3任意所述的超順磁 性功能顆粒與紅細(xì)胞孵育而成。5. 權(quán)利要求4所述的磁化紅細(xì)胞在臨床ABO血型抗體檢測(cè)、血型不規(guī)則抗體檢測(cè)篩查、 交叉配血或吸收放散實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用。6. -種權(quán)利要求1所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述制備方法包 括如下步驟： a. 活化:加入偶聯(lián)劑對(duì)細(xì)菌磁顆粒進(jìn)行活化，制得活化后的細(xì)菌磁顆粒； b. 孵育:將活化后的細(xì)菌磁顆粒與抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆抗體，室溫孵育； c. 分離:磁鐵吸附，洗滌，即得超順磁性功能顆粒； 優(yōu)選地，所述細(xì)菌磁顆粒先經(jīng)過(guò)處理步驟再進(jìn)行活化； 優(yōu)選地，所述細(xì)菌磁顆粒的處理步驟具體方法如下： (1) 取細(xì)菌磁顆粒，加入處理劑攪拌條件下反應(yīng)，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物洗滌至中性;所述 處理劑為體積比是40-60:1-3:0.3-1的無(wú)水乙醇、氨水和正硅酸乙酯的混合液； (2) 將步驟（1)反應(yīng)后得到的細(xì)菌磁顆粒配成濃度為0.1%~0.3%的溶液，調(diào)節(jié)溶液pH 值至3.0-5.0，向上述溶液中加入濃度為5-15%的3-氨丙基三乙氧基硅烷乙醇溶液中，攪拌 條件下反應(yīng)，反應(yīng)完成后將產(chǎn)物洗滌至中性，制得經(jīng)過(guò)處理的細(xì)菌磁顆粒； 優(yōu)選地，所述活化步驟具體方法如下： (a)取經(jīng)過(guò)處理的細(xì)菌磁顆粒，加入偶聯(lián)劑，攪拌反應(yīng)，過(guò)濾，制得活化后的細(xì)菌磁顆 粒，所述偶聯(lián)劑為質(zhì)量比為1:1-1.2的EDC和NHS的混合物； 優(yōu)選地，孵育的條件為：140-160rpm渦旋振蕩，室溫，反應(yīng)過(guò)夜； 優(yōu)選地，步驟b的孵育過(guò)程還加入孵育劑，所述孵育劑為重量份數(shù)比為2: 5.5-7.2的殼 聚糖和海藻酸鈉的混合物。7. 如權(quán)利要求6所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述細(xì)菌磁顆粒的 制備方法包括如下步驟： 1) 將趨磁細(xì)菌MSR-1菌株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)； 2) 離心并收集趨磁細(xì)菌MSR-1菌株，用Tris-HCl緩沖液懸浮，得懸浮液； 3) 超聲波破碎懸浮液中的細(xì)胞； 4) 磁鐵吸附破碎后的細(xì)胞，靜置過(guò)夜，棄去上清，用磷酸鹽緩沖液重新懸浮吸附到的沉 淀，超聲波清洗，磁鐵再次吸附，棄上清，將吸附到的沉淀用磷酸鹽緩沖液懸浮，洗滌3次，即 得細(xì)菌磁顆粒； 優(yōu)選地， 離心條件為:轉(zhuǎn)速8000-10000rpm，離心時(shí)間5-lOmin; 超聲波破碎條件為：超聲功率250-350?，超聲時(shí)間2-7s，間隔時(shí)間2-7s，超聲次數(shù)80- 100次，重復(fù)3次； 超聲波清洗條件為:超聲功率70-90w，超聲時(shí)間2-7s，間隔時(shí)間2-7s，超聲次數(shù)40-60 次。8. 如權(quán)利要求6所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述抗紅細(xì)胞糖蛋 白GPA單克隆抗體的制備方法包括如下步驟： I用紅細(xì)胞糖蛋白GPA免疫小鼠； Π 取免疫后的小鼠，通過(guò)融合劑與雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，將融合后的細(xì)胞懸浮于選擇 培養(yǎng)基中，進(jìn)行培養(yǎng)； m抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆抗體篩選； IV抗紅細(xì)胞糖蛋白GPA單克隆抗體的制備及純化。9. 如權(quán)利要求8所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述融合劑為質(zhì)量 比為5.6:1.2的聚乙二醇4000和聚乙二醇1500的混合物;所述選擇培養(yǎng)基由DMEM培養(yǎng)液和 懸浮溶質(zhì)組成，所述懸浮溶質(zhì)及其在DMEM培養(yǎng)液中的濃度為15-25μg/ml牛血清、15-20ng/ ηι?β-胡蘿卜素、l_3ng/ml丙酮酸鈉、5-10ng/ml維生素 E、5_10ng/ml多聚谷氨酸、2_5μg/ml殼 聚糖和25-30ng/ml堿性成纖維細(xì)胞。10. 如權(quán)利要求7所述的超順磁性功能顆粒的制備方法，其特征在于，所述趨磁細(xì)菌 MSR-1菌株擴(kuò)大培養(yǎng)包括如下步驟： a. 在培養(yǎng)罐內(nèi)加入第一培養(yǎng)基，105-110 °C滅菌lOmin，靜置lh后，將趨磁細(xì)菌MSR-1菌 株接種到培養(yǎng)罐中，進(jìn)行第一次培養(yǎng)，獲得第一培養(yǎng)液;第一次培養(yǎng)的條件為:起始pH值為 5.5-6，培養(yǎng)溫度為28-30 °C，培養(yǎng)時(shí)間為3-5天，搖床轉(zhuǎn)速為250-300轉(zhuǎn)/分鐘，培養(yǎng)過(guò)程中通 入氧氣，通入氧氣的方式為：間隔20min，通入50min氧氣； b. 將第一培養(yǎng)液加入含有第二培養(yǎng)基的培養(yǎng)罐中，無(wú)氧狀態(tài)進(jìn)行第二次培養(yǎng);第二次 培養(yǎng)的條件為:起始pH值為6.5-7.0，培養(yǎng)溫度為20-25 °C，培養(yǎng)時(shí)間為2-3天，搖床轉(zhuǎn)速為 100-200轉(zhuǎn)/分鐘； 優(yōu)選地， 所述第一培養(yǎng)基由重量份數(shù)為5-10份的谷氨酰胺、1-3份麥芽糖醇、2-5份、0.5-1份泛 酸鈣、0.5-1份酪蛋白酸鈉、0.2-0.5份磷酸二氫鉀、0.5-1份月桂酸肌氨酸和1-2份氯化鈉組 成； 所述第二培養(yǎng)基由重量份數(shù)為2-3份蛋白胨、2-5份生物素、1-2份甘氨酸、0.5-1份酒石 酸鈉、1-2份硝酸銨、1-2份磷酯酰絲氨酸和0.2-0.5份月桂醇硫酸酯鈉的組成。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供一種超順磁性功能顆粒及磁化紅細(xì)胞，細(xì)菌磁顆粒表面天然帶有豐富的-NH2基團(tuán)，通過(guò)一定的化學(xué)方法修飾使其活化并與抗紅細(xì)胞糖蛋白GP A單克隆抗體偶聯(lián)連接，制備成超順磁性功能顆粒；在臨床血型抗體檢測(cè)前，將其與紅細(xì)胞孵育并使其快速磁化，然后進(jìn)行樣本檢測(cè)，檢測(cè)過(guò)程中，磁力分離取代離心力分離，可為臨床提供一種快速、簡(jiǎn)便的試驗(yàn)方法，并且提供的超順磁性功能顆粒特別有利于紅細(xì)胞快速磁化及臨床血型抗體檢測(cè)過(guò)程中固相-液相分離。
【IPC分類(lèi)】G01N33/577, G01N33/80
【公開(kāi)號(hào)】CN105699666
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610052879
【發(fā)明人】張金菊, 王紅光
【申請(qǐng)人】北京中科圓融生物科技發(fā)展有限公司
【公開(kāi)日】2016年6月22日
【申請(qǐng)日】2016年1月26日...