一種基于雙金屬原位復(fù)合二維納米材料的電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器的制備方法及應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ]本發(fā)明涉及一種電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器的制備方法。屬于新型納米功能材料與生物傳感器技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]馬拉硫磷(malath1n)，別名馬拉賽昂，是一種藥物殺蟲(chóng)劑，適用于防治煙草、茶和桑樹(shù)等作物上的害蟲(chóng)。馬拉硫磷具有良好的觸殺，胃毒和一定的熏蒸作用，無(wú)內(nèi)吸作用。在土壤中，馬拉硫磷可通過(guò)水的淋溶作用而稍向土壤深層迀移。土壤中的馬拉硫磷可以通過(guò)植物根部吸收而進(jìn)入植物體內(nèi)。人們誤食這類植物或含有其殘留物的植物后，馬拉硫磷能通過(guò)消化道、呼吸道及完整的皮膚和粘膜進(jìn)入人體，會(huì)出現(xiàn)惡心、嘔吐、頭痛、瀉肚、全身軟弱無(wú)力等中毒初步癥狀，長(zhǎng)期接觸會(huì)導(dǎo)致癌變。
[0003]目前，檢測(cè)馬拉硫磷的方法主要有色譜法、質(zhì)譜法等。此類方法儀器貴重、操作復(fù)雜，化驗(yàn)人員需要專業(yè)培訓(xùn)后才能進(jìn)行檢測(cè)。因此，研發(fā)成本低、檢測(cè)快、靈敏度高、特異性強(qiáng)的馬拉硫磷傳感器具有重要意義。
[0004]電化學(xué)生物傳感器由于其靈敏度高、特異性好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于臨床診斷、藥物分析、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域。其中尤以無(wú)標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器研究較多，其關(guān)鍵的技術(shù)是提高修飾電極對(duì)抗體的固定量和對(duì)測(cè)試底液的信號(hào)響應(yīng)速度和大小。二氧化鈦是應(yīng)用最為廣泛的一種光催化劑材料，同時(shí)由于生物相容性好，也常被用作電極基質(zhì)材料。由于片狀二氧化鈦納米材料能夠暴露更多的高指數(shù)晶面，具有更高的催化活性，二氧化鈦納米片具有比納米粒子更好地應(yīng)用前景，對(duì)于二氧化鈦納米片的研究也備受關(guān)注。但是，二氧化鈦導(dǎo)電性差也限制了由單一二氧化鈦納米材料構(gòu)建的電化學(xué)傳感器的靈敏度普遍不高，不利于實(shí)際應(yīng)用。在半導(dǎo)體納米材料上修飾或復(fù)合特殊的納米材料，一方面增加了電極比表面積，增強(qiáng)電極導(dǎo)電能力，另一方面二者可以產(chǎn)生協(xié)同催化作用，更大的增強(qiáng)對(duì)過(guò)氧化氫溶液H2O2的催化響應(yīng)速度和電流響應(yīng)信號(hào)大小，大大提高檢測(cè)靈敏度。因此，設(shè)計(jì)、制備高效、穩(wěn)定的二氧化鈦納米片及其修飾物是制備電化學(xué)傳感器的關(guān)鍵技術(shù)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的在于提供一種制備簡(jiǎn)單、靈敏度高、檢測(cè)快速、特異性強(qiáng)的電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器的制備方法，所制備的傳感器，可用于馬拉硫磷的快速、靈敏檢測(cè)。基于此目的，本發(fā)明首先制備了一種二維片狀的磁性納米材料，即鐵和錳雙金屬原位復(fù)合的氮摻雜二氧化鈦納米片F(xiàn)eMn-NOT12,利用該材料的良好的生物相容性、大的比表面積和鐵磁性，負(fù)載上馬拉硫磷抗體，然后通過(guò)戊二醛的交聯(lián)作用固定辣根過(guò)氧化物酶，在進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，由于辣根過(guò)氧化物酶可以催化過(guò)氧化氫，產(chǎn)生電化學(xué)信號(hào)，再利用抗體與抗原的特異性定量結(jié)合對(duì)電子傳輸能力的影響，使得電流強(qiáng)度相應(yīng)降低，最終實(shí)現(xiàn)了采用無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)方法檢測(cè)馬拉硫磷的生物傳感器的構(gòu)建。
[0006]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
1.一種基于雙金屬原位復(fù)合二維納米材料的電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器的制備方法，所述的雙金屬原位復(fù)合二維納米材料為鐵和猛雙金屬原位復(fù)合的氮摻雜二氧化鈦納米片F(xiàn)eMn-NOT i O2 ；所述的電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器由工作電極、FeMn-NiT i O2、馬拉硫磷抗體、牛血清白蛋白、戊二醛、辣根過(guò)氧化物酶組成；
其特征在于，所述的制備方法包括以下制備步驟:
a.FeMn-NOT12的制備；
b.電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器的制備；
其中，步驟a制備FeMn-NOT12的具體步驟為:
首先，取0.8 mmol鐵鹽、0.8?1.2 mmol猛鹽和I mmol錢鹽加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌過(guò)程中，緩慢加入0.5-0.8 mL氫氟酸，160-200 °C下在反應(yīng)釜中反應(yīng)18?24小時(shí)，冷卻至室溫后，用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次后，50 °C下真空干燥;然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為卜3 °C/min，480?560 °C下在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，煅燒1?60 min;最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得FeMn-NOT12 ；
所述的鐵鹽選自下列之一:硫酸鐵、氯化鐵、硝酸鐵；
所述的錳鹽選自下列之一:硫酸錳、氯化錳、硝酸錳；
所述的銨鹽選自下列之一:硫酸銨、氯化銨、硝酸銨、碳酸銨；
步驟b制備電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器的具體步驟為:
(1)以玻碳電極為工作電極，在電極表面滴涂8?12uL的FeMn-NOT12溶膠，室溫下晾干；
(2)將步驟(I)中得到的電極用緩沖溶液PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8?12pL 10 μg/mL的馬拉硫磷抗體溶液，4 0C冰箱中保存晾干；
(3)將步驟(2)中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂8?12pL濃度為100 pg/mL的牛血清白蛋白溶液，4 0C冰箱中保存晾干；
(4)將步驟(3)中得到的電極用I3BS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂2?4pL的戊二醛溶液，40C冰箱中保存晾干；
(5)將步驟(4)中得到的電極用PBS清洗，繼續(xù)在電極表面滴涂6?10pL濃度為SOyg/mL的辣根過(guò)氧化物酶溶液，4 0C冰箱中保存晾干；
(6)將步驟(5)中得到的電極用PBS清洗，在4°C冰箱中保存晾干后，即制得電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器；
所述的FeMn-NOT12溶液為將50 mg的FeMn-NOT12粉末溶于10 mL超純水中，并超聲30 min后制得的水溶膠；
所述的PBS為10mmol/L的磷酸鹽緩沖溶液，所述的磷酸鹽緩沖溶液的pH值為7.4 ；
所述的戊二醛溶液為體積比為2.5%的戊二醛水溶液。
[0007]2.本發(fā)明所述的制備方法所制備的電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器的應(yīng)用，其特征在于，包括如下應(yīng)用步驟:
a.標(biāo)準(zhǔn)溶液配制:配制一組包括空白標(biāo)樣在內(nèi)的不同濃度的馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液；
b.工作電極修飾:將如權(quán)利要求1所述的制備方法所制備的電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器為工作電極，將步驟a中配制的不同濃度的馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液分別滴涂到工作電極表面，4 °C冰箱中保存；
c.工作曲線繪制:將飽和甘汞電極電極作為參比電極，鉑絲電極作為對(duì)電極，與步驟b所修飾好的工作電極組成三電極系統(tǒng)，連接電化學(xué)工作站，在電解槽中先后加入15 mL PBS和20 uL 5 mol/L的H2O2;通過(guò)計(jì)時(shí)電流法檢測(cè)組裝的工作電極對(duì)H2O2的響應(yīng)；空白標(biāo)樣的響應(yīng)電流記為1，含有不同濃度的馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的響應(yīng)電流記作I1,響應(yīng)電流降低的差值為Δ I = 10-1i, Δ I與馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度C之間成線性關(guān)系，繪制△ I一C工作曲線；
d.馬拉硫磷的檢測(cè):用待測(cè)樣品代替步驟a中的馬拉硫磷標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照步驟b和c中的方法進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)響應(yīng)光信號(hào)強(qiáng)度降低的差值A(chǔ) I和工作曲線，得到待測(cè)樣品中馬拉硫磷的含量。
[0008]本發(fā)明的有益成果
(I)本發(fā)明所述的電化學(xué)馬拉硫磷生物傳感器制備簡(jiǎn)單，操作方便，實(shí)現(xiàn)了對(duì)樣品的快速、靈敏、高選擇性檢測(cè)，并且成本低，可應(yīng)用于便攜式檢測(cè)，具有市場(chǎng)發(fā)展前景；
(2 )本發(fā)明首次制備了新型二維片狀光敏材料FeMn-NOTi O2，由于鐵、錳在二氧化鈦納米片上的原位生長(zhǎng)而充分與二氧化鈦納米片接觸，利用鐵、錳的金屬表面等離子體作用以及二者的相互促進(jìn)作用，有效提高了半導(dǎo)體基質(zhì)共振能量轉(zhuǎn)移能力，解決了二氧化鈦納米片雖然比表面積比較大及介孔特性適用于電化學(xué)基質(zhì)材料，但是電化學(xué)活性不高及電流信號(hào)不穩(wěn)定的技術(shù)問(wèn)題；同時(shí)由于氮的摻雜而使得二氧化鈦納米片更好的加大層隙間距和充分分散，極大地增大了二氧化鈦納米片的高能晶面的暴露、電子傳遞和充分分散，極大地增大了電子傳遞能力，解決了二氧化鈦納米片導(dǎo)電性差和電流響應(yīng)信號(hào)弱而不利于制備電化學(xué)傳感器的技術(shù)問(wèn)題，因此，該材料的有效制備，具有重要的科學(xué)意義和應(yīng)用價(jià)值；
(3)本發(fā)明首次將FeMn-NOT12應(yīng)用于電化學(xué)生物傳感器的制備中，顯著提高了電流信號(hào)的強(qiáng)度和穩(wěn)定性，大大提高了電化學(xué)傳感器的檢測(cè)靈敏度，使得電化學(xué)生物傳感器實(shí)現(xiàn)了在實(shí)際工作中的應(yīng)用；該材料的應(yīng)用，也為相關(guān)生物傳感器，如光電化學(xué)傳感器、電致化學(xué)發(fā)光傳感器等提供了技術(shù)參考，具有廣泛的潛在使用價(jià)值。
【具體實(shí)施方式】
[0009]實(shí)施例1 FeMn-NOT12的制備
首先，取0.8 mmol鐵鹽和0.8 mmol猛鹽和I mmol錢鹽加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌過(guò)程中，緩慢加入0.5 mL氫氟酸，160 °C下在反應(yīng)釜中反應(yīng)24小時(shí)，冷卻至室溫后，用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次后，50 °C下真空干燥;然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為I °C/min，在480 °C下煅燒60 min ;最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得FeMn_N@Ti02;
所述的鐵鹽為硫酸鐵；
所述的錳鹽為硫酸錳；
所述的銨鹽為硫酸銨。
[0010]實(shí)施例2 FeMn-NOT12的制備
首先，取0.8 mmol鐵鹽和1.0 mmol猛鹽和I mmol錢鹽加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌過(guò)程中，緩慢加入0.65 mL氫氟酸，180 °C下在反應(yīng)釜中反應(yīng)21小時(shí)，冷卻至室溫后，用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次后，50°C下真空干燥;然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為2 °C/min，在520 °C下煅燒30 min ;最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得FeMn-NiTi02 ；
所述的鐵鹽為氯化鐵；
所述的錳鹽為氯化錳；
所述的銨鹽為氯化銨。
[0011]實(shí)施例3 FeMn-NOT12的制備
首先，取0.8 mmol鐵鹽和1.2 mmol猛鹽和I mmol錢鹽加入到5 mL鈦酸四丁酯中，攪拌過(guò)程中，緩慢加入0.8 mL氫氟酸，200 °C下在反應(yīng)釜中反應(yīng)18小時(shí)，冷卻至室溫后，用超純水和無(wú)水乙醇離心洗滌三次后，50 °C下真空干燥;然后，將研磨的粉末放入馬弗爐中，升溫速度為3 °C/min，在560°C下煅燒10 min;最后，將煅燒后的粉末冷卻至室溫，即制得FeMn-NiT12;
所述的鐵鹽為硝酸鐵；
所述的錳鹽為硝酸錳；
所述的銨鹽為