一種用于伏馬毒素b1靈敏檢測的磁控比率熒光適配體傳感器的制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及材料學(xué)、光分析化學(xué)、納米生物傳感等領(lǐng)域，特指一種用于伏馬毒素 B1 靈敏檢測的磁控比率熒光適配體傳感器的制備方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 伏馬毒素(Fumonisin)是由串珠鐮刀菌、層生鐮刀菌、輪枝鐮刀菌等產(chǎn)生的次級代 謝產(chǎn)物，是一類由不同的多氫醇和丙三酸組成的結(jié)構(gòu)類似的雙酯化合物。人類迄今為止已 發(fā)現(xiàn)了 28種伏馬毒素類似物，分為A、B、C和P族4類，其中在自然界中分布廣泛、毒性較強的 是伏馬毒素 B1 (Fumonisin B1，F(xiàn)B1) AB1污染的主要是玉米及其加工產(chǎn)品，此外還有一些如 大米、小米、高粱、牛奶、啤酒等食品。FBI可誘發(fā)人體食道癌、肝癌、胃癌的發(fā)生，并且FBI為 水溶性霉菌毒素，對熱穩(wěn)定，在多數(shù)食品加工過程中均比較穩(wěn)定。為此，許多國家制訂了相 應(yīng)的限量標(biāo)準(zhǔn)，如歐盟規(guī)定嬰幼兒玉米制品中FBI和FB2的總含量為0.2mg kg"1，玉米中的限 量值為4mg kg-S美國H)A規(guī)定玉米中FB1、FB2和FB3總量的最高限量值為2mg kg-、玉米是 人類賴以生存的主要糧食品種之一，全世界年產(chǎn)近5億噸，其中我國居第二位，占總產(chǎn)量的 20%左右。我國所生產(chǎn)的玉米每年除滿足國內(nèi)需求外，還大量出口到其他國家。因此，建立 完善的伏馬毒素檢測手段和監(jiān)控機制，及時有效地發(fā)現(xiàn)和控制有關(guān)伏馬毒素的污染，及時 采取措施，從而提高中國玉米在國際市場上的質(zhì)量、信譽和品牌，保證國際貿(mào)易的順利進 行。
[0003] FBI現(xiàn)行的檢測方法主要有薄層色譜法、近紅外光譜法、酶聯(lián)免疫吸附法、氣相色 譜法、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等。其中薄層色譜法 和近紅外光譜法靈敏度低且重現(xiàn)性較差，只能用于定性或半定量分析。而酶聯(lián)免疫吸附法 假陽性率高，且對抗體的質(zhì)量要求高，不能滿足實驗室分析要求。以氣相色譜技術(shù)為基礎(chǔ)對 目標(biāo)物進行檢測是目前公認的、準(zhǔn)確檢測FBI的儀器分析法。該法具有靈敏度高、分離能力 強、特異性好、測定結(jié)果可靠等優(yōu)點;但也存在一定的局限，如需要專業(yè)的操作人員、分析周 期長、設(shè)備昂貴且需要特殊的測試環(huán)境，而且對樣品的前處理要求嚴(yán)苛，常需要對樣品進行 衍生化，不同操作過程所使用的化學(xué)藥劑和處理途徑差別較大，易對實驗結(jié)果的精確度造 成影響，且谷物中的共提取物干擾嚴(yán)重。
[0004] 核酸適配體(Aptamer)是通過體外篩選技術(shù)，從隨機單鏈寡聚核苷酸文庫中得到 的、能特異結(jié)合蛋白質(zhì)或其它小分子物質(zhì)的單鏈寡聚核苷酸。作為一種新型分子識別元件， 適配體一經(jīng)發(fā)現(xiàn)便成為生物傳感領(lǐng)域炙手可熱的研究對象和分析工具。與抗體和酶等傳統(tǒng) 的分子識別元件相比，適配體作用的靶分子范圍更廣，包括毒素、免疫原性弱和不具有免疫 原性的物質(zhì)；具有更高的特異性和親和性;熱穩(wěn)定性好、維持活性的pH值和鹽濃度范圍廣。 此外，適配體是由人工合成的，因而不依賴于動物或細胞，制備成本低、周期短，可以在合成 時定點、隨意地連接其他功能基團和分子，具有較高的純度和加工精確性。鑒于以上諸多優(yōu) 勢，近年來關(guān)于適配體的基礎(chǔ)及應(yīng)用研究均呈現(xiàn)了快速發(fā)展態(tài)勢，是目前分析化學(xué)進展最 迅速的學(xué)科前沿之一。最近，相關(guān)研究人員設(shè)計了多個適配體傳感體系，分別利用電化學(xué)、 微懸臂、熒光等研究手段，實現(xiàn)了對FBI的分析檢測。比率熒光方法是基于兩個不同波長的 熒光強度比值來達到分析檢測目標(biāo)物的方法。該方法在提高靈敏度和選擇性方面有顯著的 優(yōu)勢，近年來在生物和化學(xué)檢測中引起了廣泛關(guān)注。相比于傳統(tǒng)的單波長熒光測量，比率熒 光傳感器可以提供內(nèi)部校正以消除環(huán)境因素，激發(fā)強度變化和探針濃度等因素的干擾，大 大減少誤差，提高檢測的準(zhǔn)確性。目前報道的比率熒光傳感器多以熒光染料或量子點為探 針，用于離子檢測和生物分析等方面。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在發(fā)明一種具有工藝簡單、成本低廉等優(yōu)點的磁控比率熒光適配體傳感 器，提供一種制備高選擇性、高精確性，測量范圍寬的高靈敏檢測FBI的方法，解決現(xiàn)有檢測 方法成本高、檢測方案復(fù)雜、檢測時間過長、靈敏度較低、激發(fā)強度變化和探針濃度易受干 擾等難題。
[0006] 所采用的方案概括為：首先，在Si02表面靜電吸附發(fā)射綠色熒光的CdTe量子點 (gQDs)制備Si〇2@gQDs，并將其作為熒光探針與FBI的Aptamer偶聯(lián);其次，以改進的st6ber法 合成Fe 3〇4@Si02磁性納米微球(mSi02)，在mSi02表面靜電吸附發(fā)射紅色熒光的CdTe量子點 (rQDs)制得mSi〇2@rQDs，并將其作為磁性-焚光探針與aptamer的互補DNA(cDNA)偶聯(lián)；最 后，利用Aptamer與cDNA之間的雜交反應(yīng)將Si0 2@gQDs捕獲在mSi〇2@rQDs制得mSi〇2@rQDs-cDNA/aptamer-gQDs@Si〇2磁控-焚光-分子革El向納米生物復(fù)合物。該探針與目標(biāo)物FBI作用 后，對其施加外源磁場分離富集未脫附的熒光信標(biāo)，形成比率熒光適配體傳感體系，實現(xiàn)對 FBI的靈敏檢測。該比率熒光適配體傳感方法可以提供內(nèi)部校正，消除環(huán)境因素、激發(fā)強度 變化和探針濃度等因素的干擾，相比于單波長熒光檢測，在提高靈敏度和精確度方面具有 非常顯著的優(yōu)勢。
[0007] 本發(fā)明是通過如下具體技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0008] 一種用磁控比率熒光適配體傳感器靈敏檢測伏馬毒素 B1 (FBI)的方法，包括如下 步驟：
[0009] 步驟1、發(fā)射綠色熒光的水溶性CdTe量子點（簡稱為gQDs)水溶液和發(fā)射紅色熒光 的水溶性CdTe量子點(簡稱為rQDs)水溶液的制備；
[0010 ]步驟2、單分散S i02納米球分散液的制備；
[0011 ] 步驟3、Fe3〇4@S i 02磁珠 (mS i02)分散液的制備；
[0012] 步驟4、gQDs包覆的Si02 (簡稱為Si02@gQDs)分散液納米球的制備:取步驟2制備的 Si02納米球分散液和0.02M NaCl溶液溶解的聚二烯丙基二甲基氯化銨(PDDA)溶液于燒杯 中混合均勻，磁力攪拌反應(yīng);產(chǎn)物經(jīng)離心分離、洗滌后，再加入步驟1中制備的gQDs水溶液， 于避光條件下磁力攪拌反應(yīng)，經(jīng)離心分離、洗滌后，避光自然干燥，將干燥后的產(chǎn)物分散到 蒸餾水中，得到Si0 2@gQDs分散液，備用；
[0013] 步驟5、rQDs包覆mSi02納米球(簡稱為mSi02@rQDs)分散液的制備:取用步驟3中制 備的mSi02分散液，向其中加入聚二烯丙基二甲基氯化銨溶液，機械攪拌反應(yīng);將產(chǎn)物磁性 分離，二次水洗3次后，加入二次水將其重新分散，制得聚二烯丙基二甲基氯化銨修飾的 mSi〇2(簡稱為mSi〇2_PDDA);最后，加入rQDs水溶液機械攪拌，經(jīng)磁性分離，二次水洗后，避光 自然干燥，將干燥后的mSi02@rQDs分散在二次水中，得到mSi02@rQDs分散液，備用；
[0014] 步驟6、Si〇2@gQDs標(biāo)記的Aptamer (簡稱為Si〇2@gQDs_Aptamer)焚光探針分散液的 制備:取步驟4制備的Si02@gQDs分散液，加入1-(3_二甲氨基丙基)-3_乙基碳二亞胺鹽酸鹽 (EDC)水溶液和N-羥基丁二酰亞胺(NHS)水溶液，振蕩反應(yīng)，隨后加入Aptamer儲備液，振蕩 孵育過夜，反應(yīng)完畢后，離心洗滌產(chǎn)物，將產(chǎn)物重新分散在Tris-HCl溶液中，得到Si0 2@ gQDs-Aptamer分散液，備用；
[0015] 步驟 7、mSi〇2@rQDs 標(biāo)記的 Aptamer 的互補鏈 cDNA (簡稱為 mSi〇2@rQDs_cDNA)磁性-熒光探針分散液的制備：取步驟5制備的mSi 02@rQDs的分散液，加入EDC水溶液和NHS水溶 液，振蕩反應(yīng)，加入cDNA，振蕩孵育過夜，振蕩孵育過夜，反應(yīng)完畢后，離心洗滌產(chǎn)物，將產(chǎn)物 重新分散在Tris-HCl溶液中，得到mSi0 2@rQDs-CDNA分散液，備用；
[0016] 步驟8、傳感器的構(gòu)建及樣品的檢測，包括:磁控-比率熒光-靶向納米生物復(fù)合物 的制備：取步驟6制備的Si02@gQDs-Aptamer熒光探針分散液和步驟7制備的mSi0 2@rQDs-cDNA磁性-熒光探針分散液混合，進行第一次恒溫振蕩孵育，制得mSi02irQDs-cDNA/ Aptamer_gQDs@Si〇2 納米生物復(fù)合物，對產(chǎn)物 mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2 納米生 物復(fù)合物磁性分離、洗滌后，重新分散在Tris-HCl緩沖溶液A中，備用；
[0017] 對FBI標(biāo)準(zhǔn)品進行檢測，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線：取所制備的mSiC^OrQDs-cDNA/Aptamer-gQDsOSiCfe 納米生物復(fù)合物與 FBI 溶液混合， 進行第二次恒溫振蕩孵育; 經(jīng)磁性分離后 ，棄去 已脫附的Si〇2@gQDs，將收集得到的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@Si〇2納米生物復(fù)合物 洗滌后，重新分散在Tris-HCl緩沖溶液B中，設(shè)置激發(fā)波長為365nm，掃描得到熒光譜圖，通 過熒光強度比（I g/Ir)/(Ig/Ir)()與FBI標(biāo)準(zhǔn)品濃度之間的對應(yīng)關(guān)系建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中，（I g/ Ir)和（Ig/Ir)o分別為存在與不存在FBI時，磁性收集的mSi〇2@rQDs-cDNA/Aptamer-gQDs@ Si02納米生物復(fù)合物所測得的gQDs熒光強度(Ig)和rQDs熒光強度(Ir)的比值；
[0018] 步驟9、對待測樣按照步驟8同樣的方法進行檢測，依據(jù)步驟8得到的標(biāo)準(zhǔn)曲線得