物理隔離(此處主要是隔熱)。熱梯度微反應(yīng)器的熒光檢測(cè)區(qū)與智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器之間的光路均進(jìn)行密閉避光處理(即采用遮光卡片擋光)。
[0092]在使用手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，首先由鍵盤輸入設(shè)定的溫度值、微流體流速后，電子控制系統(tǒng)中的溫度控制單元開啟熱梯度微反應(yīng)器中的加熱元件和微型渦輪風(fēng)扇，由溫度傳感器監(jiān)控實(shí)時(shí)溫度并反饋給溫度控制單元，并由LED顯示；待穩(wěn)定達(dá)到設(shè)定溫度值后，微流體驅(qū)動(dòng)器中的減速步進(jìn)電機(jī)按預(yù)先設(shè)定程序?qū)崿F(xiàn)精確取樣；同時(shí)，開啟智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器，當(dāng)微流體流至熒光檢測(cè)區(qū)時(shí)，智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器的攝像頭進(jìn)行熒光圖像的實(shí)時(shí)采集，獲得的熒光圖像顯示在智能手機(jī)的顯示屏進(jìn)行直接判讀分析，或使用USB數(shù)據(jù)線或者無線網(wǎng)絡(luò)傳輸至計(jì)算機(jī)，計(jì)算機(jī)通過圖像分析軟件對(duì)圖像上的像素點(diǎn)進(jìn)行分析，產(chǎn)生相應(yīng)的擴(kuò)增曲線與融解曲線。
[0093]本實(shí)施例中，加熱元件的設(shè)定溫度值為94°C，微型渦輪風(fēng)扇的工作電壓設(shè)置為3.5V，微流體的驅(qū)動(dòng)線性流速為4mm/s，攝像頭的光圈數(shù)為f/2.4，焦距為4mm，使用的采集頻率為0.1Hz，使用的感光度ISO為1600。
[0094]本實(shí)施例中的樣品為單增李斯特菌基因組DNA、沙門氏菌基因組DNA和金葡萄球菌基因組DNA，PCR反應(yīng)體系包括I XPCR緩沖液，200 μ M dNTPs (脫氧核糖核苷三磷酸)，0.04ng/ μ L BSA (小牛血清蛋白)，200nM 引物對(duì)，I X EvaGreen?焚光染料，0.2unit//UL Taq聚合酶，反應(yīng)體積為10 μ L。其中，單增李斯特菌DNA對(duì)應(yīng)的引物對(duì):上游引物5’-3’ CAAGT CCTAA GACGC CAATC,下游引物 5’ -3’CAAGTCCTAAGACGCCAATC ;金葡萄球菌DNA 對(duì)應(yīng)的引物對(duì):上游引物 5 ’ -3 ’ GGTCCTGAAGCAAGTGCATT,下游引物 5 ’ -3 ’ ATACG CTAAGCCACG TCCAT ;沙門氏菌DNA對(duì)應(yīng)的引物對(duì):上游引物5’ -3’ TGCTCAGACATGCCACAGT，下游引物 5’ -3’ TGCTC GTAAT TCACC ACCAT TG。
[0095]本實(shí)施例中計(jì)算機(jī)使用的圖像分析軟件為現(xiàn)有的ImageJ，生成擴(kuò)增曲線和融解曲線的過程如下。
[0096]擴(kuò)增曲線:⑴將采集到的擴(kuò)增過程中的原始熒光圖像按時(shí)間順序?qū)R成一幅組合圖像，同時(shí)使每一幅原始圖像上的熒光通道都在組合圖像上顯示出來，如圖9所示；(2)分離組合圖像的RGB通道，僅保留熒光信息所在的綠色通道；(3)提取該綠色通道圖像上垂直于熒光通道方向的寬度為100像素點(diǎn)的灰度值并繪制其灰度曲線；(4)使用浮動(dòng)坐標(biāo)提取每一條熒光通道上的最高灰度值Imax和其兩側(cè)相鄰熒光通道之間區(qū)域的最低灰度值I min，每一條熒光通道上的Imax減去其對(duì)應(yīng)I min的平均值得到該熒光通道的灰度值I ; (5)以熒光通道數(shù)為橫坐標(biāo)，以熒光通道的灰度值為縱坐標(biāo)，并通過一階Savitzky-Golay平滑窗口平滑數(shù)據(jù)點(diǎn)后得到擴(kuò)增曲線，如圖10所示；(6)擴(kuò)增曲線對(duì)應(yīng)的閾值循環(huán)數(shù)Ct值通過二階求導(dǎo)法產(chǎn)生。
[0097]融解曲線:(1)選擇需要分析的熒光圖像，如圖11所示，分離其圖像的RGB通道，僅保留熒光信息所在的綠色通道；(2)去除圖像的背景灰度，提取該綠色通道圖像上覆蓋熒光通道方向的寬度為10像素點(diǎn)的灰度值并繪制其灰度曲線；(3)以像素點(diǎn)為橫坐標(biāo)，以熒光通道的灰度值為縱坐標(biāo)，并通過一階Savitzky-Golay平滑窗口平滑數(shù)據(jù)點(diǎn)后得到基于像素點(diǎn)的融解曲線；(4)根據(jù)空間溫度分辨率(V /pixel)將像素點(diǎn)轉(zhuǎn)換為溫度點(diǎn)T’，并根據(jù)微型渦輪風(fēng)扇的工作電壓得出對(duì)應(yīng)融解起始點(diǎn)的溫度Ttl(渦輪風(fēng)扇的工作電壓與融解起始點(diǎn)溫度的對(duì)應(yīng)關(guān)系可以通過預(yù)先測(cè)得空間溫度分布表查得)，通過L+T’得到每一個(gè)像素點(diǎn)對(duì)應(yīng)的實(shí)際溫度點(diǎn)，從而得到基于溫度的融解曲線，如圖12所示。
[0098]上述實(shí)施例為本實(shí)用新型較佳的實(shí)施方式，但本實(shí)用新型的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本實(shí)用新型的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本實(shí)用新型的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:包括: -用于樣品擴(kuò)增且在上表面形成熒光檢測(cè)區(qū)的熱梯度微反應(yīng)器， -用于激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光并記錄熒光圖像的智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器， -用于將樣品定量抽取至熱梯度微反應(yīng)器的微流體驅(qū)動(dòng)器， -電源組件， -與熱梯度微反應(yīng)器、智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器、微流體驅(qū)動(dòng)器、電源組件分別相接的電子控制系統(tǒng)， -含絕熱底板的避光外殼； 熱梯度微反應(yīng)器、微流體驅(qū)動(dòng)器、電源組件、電子控制系統(tǒng)均安裝在絕熱底板上，智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器位于熱梯度微反應(yīng)器的正上方。
2.按照權(quán)利要求1所述的手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:所述熱梯度微反應(yīng)器、電子控制系統(tǒng)、電源組件從左往右依次設(shè)置，微流體驅(qū)動(dòng)器位于熱梯度微反應(yīng)器的前方。
3.按照權(quán)利要求2所述的手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:所述熱梯度微反應(yīng)器包括:發(fā)熱基底、微通道、加熱元件、溫度傳感器和供發(fā)熱基底散熱的散熱裝置； 發(fā)熱基底包括:位于左側(cè)的實(shí)心柱體段和位于右側(cè)的空心柱體段；空心柱體段的橫截面為開口朝向?qū)嵭闹w段的U形，實(shí)心柱體段與位于上方的U形開口的一端相接且與位于下方的U形開口的另一端斷開； 微通道呈螺線管式纏繞在發(fā)熱基底外，螺線管的軸線、發(fā)熱基底的長(zhǎng)度方向均沿著前后方向設(shè)置； 加熱元件和溫度傳感器安裝在實(shí)心柱體段內(nèi)。
4.按照權(quán)利要求3所述的手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:所述實(shí)心柱體段的左端表面為半圓柱面，空心柱體段的右端表面也為半圓柱面，兩半圓柱面的半徑相同；發(fā)熱基底的外表面設(shè)有呈螺線管式分布的U形溝槽，微通道嵌入U(xiǎn)形溝槽中；實(shí)心柱體段的長(zhǎng)度大于空心柱體段的長(zhǎng)度；實(shí)心柱體段的前端與空心柱體段的前端對(duì)齊，實(shí)心柱體段的后端凸出于空心柱體段的后端；實(shí)心柱體段內(nèi)開設(shè)沿著實(shí)心柱體段的長(zhǎng)度方向延伸的圓形通孔，實(shí)心柱體段內(nèi)還開設(shè)沿著實(shí)心柱體段的長(zhǎng)度方向延伸的插孔； 加熱元件為電加熱棒，安裝在圓形通孔內(nèi)；溫度傳感器安裝在插孔內(nèi)； 散熱裝置包括:散熱片和朝向散熱片吹風(fēng)的微型渦輪風(fēng)扇； 空心柱體段的下端具有一個(gè)凸出塊，凸出塊安裝在散熱片上，散熱片和微型渦輪風(fēng)扇均安裝在絕熱底板上。
5.按照權(quán)利要求2所述的手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:所述智能手機(jī)寬場(chǎng)焚光成像器包括: -帶有攝像頭的智能手機(jī)， -沿著水平方向發(fā)出可激發(fā)熒光的出射光的熒光激發(fā)光源， -使得熒光激發(fā)光源的出射光垂直向下轉(zhuǎn)向并且使得被激發(fā)的熒光沿?zé)晒獾脑瓊鞑シ较虼┻^的二向色性濾光片， -光闌， -發(fā)射濾片； 攝像頭、發(fā)射濾片、二向色性濾光片、光闌、熒光檢測(cè)區(qū)從上往下依次設(shè)置；發(fā)射濾片、光闌相互平行，且均與二向色性濾光片成45度角；熒光激發(fā)光源的出射光與二向色性濾光片成45度角；熒光激發(fā)光源位于二向色性濾光片的右側(cè)。
6.按照權(quán)利要求5所述的手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:所述熒光激發(fā)光源包括:從左往右依次設(shè)置的激發(fā)濾片、聚光透鏡、LED燈；LED燈的右端接有LED燈散熱底座；攝像頭位于智能手機(jī)的背面，智能手機(jī)的正面設(shè)有顯示攝像頭拍攝的熒光圖像的顯示屏。
7.按照權(quán)利要求2所述的手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:所述微流體驅(qū)動(dòng)器包括:注射器、絲桿滑塊機(jī)構(gòu)、減速步進(jìn)電機(jī)；減速步進(jìn)電機(jī)通過絲桿滑塊機(jī)構(gòu)驅(qū)動(dòng)絲桿滑塊機(jī)構(gòu)中的滑塊平移；注射器的針筒與絕熱底板相對(duì)固定，注射器的推塊與滑塊相接并由滑塊帶動(dòng)平移。
8.按照權(quán)利要求2所述的手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:所述電子控制系統(tǒng)集成在一塊印刷電路板上，印刷電路板立起固定在絕熱底板上。
9.按照權(quán)利要求8所述的手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:所述電源組件為充電電池組，充電電池組固定在絕熱底板上。
10.按照權(quán)利要求4所述的手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)，其特征在于:所述避光外殼將熱梯度微反應(yīng)器、微流體驅(qū)動(dòng)器、電源組件、電子控制系統(tǒng)全部包裹，避光外殼將智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器部分包裹，智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器中智能手機(jī)的顯示屏露出避光外殼夕卜； 絕熱底板上對(duì)應(yīng)微型渦輪風(fēng)扇的位置開有通風(fēng)柵格，避光外殼對(duì)應(yīng)散熱片的出風(fēng)口位置開有散熱口。
【專利摘要】手持式POCT流式基因分析系統(tǒng)包括：用于樣品擴(kuò)增且在上表面形成熒光檢測(cè)區(qū)的熱梯度微反應(yīng)器，用于激發(fā)樣品產(chǎn)生熒光并記錄熒光圖像的智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器，用于將樣品定量抽取至熱梯度微反應(yīng)器的微流體驅(qū)動(dòng)器，與熱梯度微反應(yīng)器、智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器、微流體驅(qū)動(dòng)器、電源組件分別相接的電子控制系統(tǒng)，電源組件，含絕熱底板的避光外殼；熱梯度微反應(yīng)器、微流體驅(qū)動(dòng)器、電源組件、電子控制系統(tǒng)均安裝在絕熱底板上，智能手機(jī)寬場(chǎng)熒光成像器位于熱梯度微反應(yīng)器的正上方。本實(shí)用新型結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、體積小巧，操作方便，可現(xiàn)場(chǎng)使用，檢測(cè)過程/結(jié)果直接可視，可進(jìn)行高速、高靈敏、多元且實(shí)時(shí)定量的核酸檢測(cè)，屬于體外分子診斷技術(shù)領(lǐng)域。
【IPC分類】G01N21-01, G01N21-64, G01N35-00
【公開號(hào)】CN204439650
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201520180740
【發(fā)明人】章春筍, 邢達(dá), 舒博文
【申請(qǐng)人】華南師范大學(xué)
【公開日】2015年7月1日
【申請(qǐng)日】2015年3月27日