一種抗cuzd1抗體免疫層析試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實用新型涉及一種層析試紙條，屬于醫(yī)學(xué)免疫分析檢測領(lǐng)域。 技術(shù)背景
[0002] 炎性腸?。↖BD)包括克羅恩?。–D)與潰瘍性結(jié)腸炎（UC)，其病因迄今仍不明確。 IBD在全球范圍內(nèi)分布具有明顯地域差異性，其在歐美國家高發(fā)，尤其是北美和北歐。以前 認(rèn)為IBD在亞洲國家包括中國發(fā)病率很低，但近20年來中國報道的臨床IBD病例越來越 多，其發(fā)病呈上升趨勢。目前的臨床診斷條件下，在UC與CD及IBD與非IBD的鑒別診斷上 有時很困難，在缺乏組織學(xué)證據(jù)時，需有更多相對特異性的標(biāo)志物為診斷提供幫助。研究發(fā) 現(xiàn)，多種非侵入性的生物活性標(biāo)志物對IBD的診斷及炎癥活動性的評價具有重要意義。
[0003] CUB帶狀瘡疹透明區(qū)樣域蛋白I(CUZDl)是近期發(fā)現(xiàn)的存在于胰腺中的一種自身 免疫性抗原，它的自體免疫性抗體以網(wǎng)狀顆粒形式存在于炎癥性腸?。↖BD)，尤其是克隆恩 ?。–D)患者體內(nèi)。據(jù)臨床研究分析，高于30%的CD患者體內(nèi)能夠用免疫熒光技術(shù)檢測出 CUZDl抗體的存在。大量研究反映出瘡疹透明區(qū)樣域蛋白I(CUZDl)自體免疫抗體與炎癥性 腸?。↖BD)尤其是克隆恩?。–D)具有高度的相關(guān)性。
[0004] 目前市場上⑶ZDl抗體的檢測方法多為酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA)及間接免疫熒光 (Indirect immunofluorescence，IFA)檢測技術(shù)。ELISA法檢測可用于高通量標(biāo)本測定，靈 敏度也比較高，目前也被廣泛認(rèn)可，但其操作比較繁瑣，需要多次加樣洗滌及孵育步驟，完 成整個實驗過程需要3小時左右，需要酶標(biāo)儀，對于實驗人員專業(yè)技術(shù)要求比較高，同時受 到各種環(huán)境條件的影響，對實驗帶來諸多不便。
[0005] 間接免疫熒光檢測技術(shù)是把抗原細(xì)胞固定在載玻片上，熒光染色用熒光顯微鏡進(jìn) 行觀察，該技術(shù)具有高特異性，但由于顯微鏡觀察需要主觀判斷，對檢驗人員的要求高，并 且依賴于熒光顯微鏡，使用不便。
[0006] 免疫層析法（immunochromatography)是近幾年來興起的一種快速診斷技術(shù)，其 原理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜或醋酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的纖維 素一端浸入樣品（尿液或血清）后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至 固定有抗體的區(qū)域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見的檢 測帶?，F(xiàn)有的免疫層析試紙條產(chǎn)品常用的示蹤標(biāo)記粒子有納米金、納米硒、彩色膠乳等等， 其中以納米金應(yīng)用最為廣泛，納米金也稱為膠體金。
[0007] 以膠體金作為失蹤標(biāo)記物的免疫層析技術(shù)特稱為免疫膠體金技術(shù)（Immune colloidal gold technique，GICT)。膠體金是由氯金酸（HAuC14)在還原劑如白磷、抗壞 血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn) 定的膠體狀態(tài)而得名。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成 牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白 質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些 物理性狀，如高電子密度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因 而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。膠體金層析法的優(yōu) 點主要包括：（1)使用方便快速，便于基層使用和現(xiàn)場使用，所有反應(yīng)能在15分鐘內(nèi)完成； (2)成本低，不需要特殊的儀器設(shè)備；(3)應(yīng)用范圍廣，可適應(yīng)多種檢測條件；(4)可以進(jìn)行 多項檢測，若陽性樣本比較難獲得，多項檢測可以節(jié)省樣品，降低成本；（5)標(biāo)記物穩(wěn)定，標(biāo) 記樣品在4°C貯存兩年年以上，無信號衰減現(xiàn)象；(6)膠體金本身為紅色，不需要加入發(fā)色 試劑，省卻了酶標(biāo)的致癌性底物及終止液的步驟，對人體無毒害。
[0008] 表面帶活性基團(tuán)的彩色膠乳微球也可以作為免疫層析的示蹤劑，與膠體金技術(shù)一 樣，彩色膠乳標(biāo)記免疫層析技術(shù)也具有操作簡便、試劑穩(wěn)定、快速出結(jié)果、可室溫保存等優(yōu) 點。彩色膠乳標(biāo)記是將不同直徑范圍0.1 um-Ium彩色膠乳微球與含有羧基、氨基、羥基等酯 類或其他大分子物質(zhì)共價結(jié)合，使這些大分子標(biāo)記上顏色，當(dāng)在檢測線或質(zhì)控線上富集停 留后形成肉眼可見的彩色條帶。
[0009] 目前國內(nèi)商品化的CUZDl試劑是間接免疫熒光試劑，用于IBD診斷的靈敏度為 8-20 %，特異性為95 %以上，本實用新型的⑶ZDl免疫層析試紙在保證特異性的情況下，各 種試紙條用于IBD診斷的靈敏度均比現(xiàn)有產(chǎn)品有顯著提高。 【實用新型內(nèi)容】
[0010] 本實用新型所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有方法的不足，將免疫層析法應(yīng)用 到抗CUZDl抗體的檢測中，采用間接免疫法來實現(xiàn)對樣品中的CUZDl抗體進(jìn)行檢測，通過把 CUZDl抗原蛋白包被在結(jié)合墊或分析膜檢測帶上，實現(xiàn)對樣品中CUZDl抗體的高特異、高準(zhǔn) 確性的檢測，快速篩查抗CUZDl抗體陽性標(biāo)本，為臨床炎癥性腸病等自體免疫性疾病提供 快速的輔助診斷。
[0011] 本實用新型所要解決的技術(shù)問題在于提供一種免疫層析法抗⑶ZDl抗體測試紙 條。
[0012] 本實用新型所要解決的技術(shù)問題可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0013] -種抗CUZDl抗體免疫層析試紙條，包括樣品墊（1)、結(jié)合墊（2)、分析膜（3)、吸水 墊（6)、底板（7)、檢測帶T線⑷和質(zhì)控帶C線（5)，所述底板的上部貼合有分析膜，所述分 析膜上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊和吸水墊，所述結(jié)合墊上部的一端貼合有樣品墊，所述 檢測帶T線和質(zhì)控帶C線設(shè)置在分析膜上。
[0014] 所述的結(jié)合墊（2)包被膠體金或彩色膠乳標(biāo)記物。
[0015] 優(yōu)選例1中，所述的結(jié)合墊⑵包被有標(biāo)記的⑶ZDl抗原蛋白，所述的檢測帶T線 (4)包被有抗人IgG，所述的質(zhì)控帶C線（5)包被有CUZDl的單克隆或多克隆抗體的一種或 多種。
[0016] 所述的CUZDl單克隆或多克隆抗體是指用CUZDl抗原蛋白作為免疫原所獲得的鼠 源、兔源、馬源、豚鼠源、駱駝源的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0017] 優(yōu)選例2中，所述的結(jié)合墊（2)包被有標(biāo)記的⑶ZDl抗原蛋白和標(biāo)記物b層；所述 的檢測帶T線（4)包被有抗人IgG，所述的質(zhì)控帶C線（5)包被有蛋白C。
[0018] 優(yōu)選例3中，所述的結(jié)合墊（2)包被有標(biāo)記物a層和標(biāo)記物b層；所述的檢測帶T 線⑷包被有CUZDl抗原，所述的質(zhì)控帶C線（5)包被有蛋白C。
[0019] 所述標(biāo)記物a層的標(biāo)記蛋白為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球 菌A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（Protein G)中的一種或多種。
[0020] 所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源、駱駝源或豚鼠源中的一種； 所述的抗人IgG單克隆抗體為鼠源、駱駝源或兔源中的一種。
[0021] 所述的控制線上的蛋白C與標(biāo)記物b層中的標(biāo)記蛋白B同時或不同時為單克隆抗 體或多克隆抗體中的一種，并且標(biāo)記物b層中的標(biāo)記蛋白B和質(zhì)控線上的蛋白C可發(fā)生特 異性結(jié)合形成免疫復(fù)合物。所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源、駱駝源或豚鼠源中 的一種，所述的單克隆抗體為鼠源、駱駝源或兔源中的一種。
[0022] 本實用新型所用的包被在質(zhì)控帶C線上的蛋白包括但不限于：CUZDl的特異性單 抗或多抗、動物的免疫球蛋白或抗其抗體，但必須能與結(jié)合墊b層的標(biāo)記蛋白發(fā)生免疫結(jié) 合反應(yīng)，形成免疫復(fù)合物。比如結(jié)合墊b層的包被蛋白是標(biāo)記的⑶ZD1，質(zhì)控帶的包被蛋白 是任何動物來源的抗CUZDl抗體；如果結(jié)合墊b層的包被蛋白是鼠 IgG，質(zhì)控帶的包被蛋白 是任何動物來源的抗鼠 IgG的單抗或多抗。選用哪一對的結(jié)合墊b層蛋白和質(zhì)控帶C線蛋 白不是本實用新型的關(guān)鍵，實施例例舉幾組常用的結(jié)合墊b層標(biāo)記蛋白與質(zhì)控帶C線包被 蛋白組合，其目的不是限制該組合類型。
[0023] 所述的CUZDl抗原蛋白為通過原核/真核表達(dá)系統(tǒng)克隆化基因獲得，或通過多肽 合成儀合成重要抗原表位偶聯(lián)到載體蛋白上獲得。
[0024] 所述檢測是定性檢測樣本中的抗CUZDl抗體，對炎癥性腸病進(jìn)行輔助診斷。所述 樣本為血清、血漿、全血或其他體液。
[0025] 本實用新型所用的單克隆抗體用現(xiàn)有技術(shù)雜交瘤方法制備或者通過重組DNA法 進(jìn)行制備。
[0026] 本實用新型所用的多克隆抗體或通過免疫動物來制備。
[0027] 本實用新型所用的⑶ZDl抗原蛋白、SPA、Protein G用基因工程方法獲得。
[0028] 本實用新型的檢測原理為（以結(jié)合墊上的標(biāo)記蛋白A為⑶ZDl蛋白，B為兔IgG為 例）：
[0029] 膠體金或彩色膠乳標(biāo)記的蛋白A和蛋白B噴涂于結(jié)合墊，分析膜檢測帶T線上包 被抗人IgG，質(zhì)控帶C線上包被抗兔IgG。當(dāng)樣本隨著層析泳動到結(jié)合墊并浸潤膠體金或膠 乳標(biāo)記物時，其中的人IgG和標(biāo)記蛋白A結(jié)合形成人IgG-標(biāo)記蛋白A復(fù)合物，由于毛細(xì)管效 應(yīng)，此復(fù)合物沿向吸水墊方向泳動，如果樣品中含有抗CUZDl抗體，此復(fù)合物與包被于檢測 帶T線上的抗人IgG發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成金標(biāo)/膠乳蛋白A (CUZDl)-人抗CUZDl IgG抗體-抗人IgG三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶 或膠乳顏色；由于毛細(xì)效應(yīng)繼續(xù)泳動向前，金標(biāo)/膠乳兔IgG與包被在質(zhì)控線上的羊抗兔 IgG發(fā)生特異的免疫反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成較深的紫紅色條帶或膠乳顏色， 多余的未結(jié)合的物質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線和質(zhì)控線