豬o型口蹄疫病毒抗體的elisa檢測試劑盒的制作方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型屬于獸用疫病檢測技術領域，具體涉及一豬〇型口蹄疫病毒抗體的 ELISA檢測試劑盒，可用于動物疫病流行病的檢測與調查。
【背景技術】
[0002] 豬口蹄疫?。‵oot and mouth disease, FMD)是由口蹄疫病毒引起的以患病動物 的口、蹄部出現(xiàn)水皰性病癥為特征的傳染性疫病。主要侵害偶蹄獸，偶見于人和其它動物。 口蹄疫病毒具有多型性、易變性，有7個血清型（A型、0型、C型、亞洲1型、南非1型、南非 2型、南非3型)，型間無交叉保護，每個血清型又分多種亞型。我國主要流行0型口蹄疫與 亞洲1型口蹄疫?？谔阋咂鸩〖?、傳播極為迅速，發(fā)病率可達100%，仔豬常不見癥狀而猝死， 嚴重時死亡率可達100%。對我國養(yǎng)豬業(yè)的健康發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟損失，成為嚴重危害 養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重大傳染病之一，屬于我國A類動物疫病。由此可見，使用豬口蹄疫相關 疫苗進行免疫注射，并對免疫效果進行在線監(jiān)測以確定其是否產(chǎn)生相應的抗體保護水平具 有非常重大的意義。
[0003] 口蹄疫病毒屬于微核糖核酸病毒科口蹄疫病毒屬，由VPl，VP2和VP3組成衣殼蛋 白亞單位，其中VPl蛋白為序列依賴性表位，可誘導產(chǎn)生中和抗體。傳統(tǒng)的ELISA方法以全 病毒作為抗原檢測抗體，而生產(chǎn)全病毒需要昂貴的培養(yǎng)基，且存在散毒的危險。VPl作為口 蹄疫病毒最重要的結構蛋白，具有良好的免疫原性和特異性，可作為理想的血清學檢測用 抗原。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 本實用新型的目的是為了提供一種快速、有效、批量檢測豬0型口蹄疫病毒抗體 的ELISA檢測試劑盒。
[0005] 為了實現(xiàn)上述目的，本實用新型采用如下技術方案：
[0006] -種豬0型口蹄疫病毒抗體的ELISA檢測試劑盒，該試劑盒有一個盒體，其中，所 述盒體內(nèi)設有抗原包被反應板、豬〇型口蹄疫病毒抗體陽性對照血清、豬〇型口蹄疫病毒抗 體陰性對照血清、樣本稀釋液、20 X濃縮洗滌液、酶標記物、顯色劑和終止液。
[0007] 具體的，所述的豬0型口蹄疫病毒VPl重組蛋白為利用基因工程技術提取的高純 度的原核表達蛋白，可按本領域常規(guī)技術制備或購買市售產(chǎn)品均可。
[0008] 所述抗原包被反應板的規(guī)格為96孔X2(96TX2)，包被有純化的豬0型口蹄疫病 毒結構蛋白VPl。
[0009] 所述的酶標記結合物為酶標記的羊抗豬IgG。
[0010] 所述的底物液為含有3, 3〃，5, 5〃-四甲基聯(lián)苯胺（TMB)的單底物顯色劑。
[0011] 本實用新型采用酶聯(lián)免疫間接法，將豬0型口蹄疫病毒VPl蛋白抗原包被到抗原 反應板內(nèi)，該抗原可與待檢樣本中的VPl抗體產(chǎn)生特異性結合，形成"抗原-抗體"復合物 被吸附于固相包被反應板上，再加入酶標記物(酶標記的羊抗豬IgG)，形成固相"抗原+抗 體+酶標抗豬IgG抗體"復合物，加入顯色劑，通過酶催化反應顯色。顯色深淺與待檢樣本 中特異性抗體的量成正相關。當樣本反應顯色后，經(jīng)酶標儀檢測所得結果超過設定的臨界 值結果判為陽性，反之則為陰性。
[0012] 本實用新型以基因表達的重組蛋白為檢測抗原，安全性好，特異性好，靈敏度高， 適用于大批量檢測；同時試驗操作時的試劑的顏色變化，試劑液體與瓶蓋的不同顏色，利于 操作人員區(qū)分不同液體，降低人為操作失誤的可能性，便于試驗操作。
【附圖說明】
[0013] 圖1為本實用新型所述試劑盒的橫切面剖視圖，包含盒體內(nèi)所有物品的位置與組 成。其中，2為抗原包被反應板2塊；3為樣本稀釋液50ml ;4為20 X濃縮洗滌液50ml ;5為 酶標記物22ml ;6為陽性對照血清I. 5ml ;7為陰性對照血清I. 5ml ;8為顯色劑12ml/瓶X 2 瓶；9為終止液12ml ;10為操作說明書1張；11為蓋板膜6張；1為盒體。
【具體實施方式】
[0014] 下面結合附圖對本實用新型做進一步詳細說明，但本實用新型的保護范圍不限于 此。
[0015] -種豬0型口蹄疫病毒抗體ELISA檢測試劑盒，如圖1所示，該試劑盒有一個盒體 1。其中，所述盒體1內(nèi)設有抗原包被板2、樣本稀釋液3、20 X濃縮洗滌液4、酶標記物5、陽 性對照血清6、陰性對照血清7、顯色劑8、終止液9、說明書10和蓋板膜11。所述抗原包被 板規(guī)格為96孔，每個盒體包括2塊抗原包被板，其中包被有純化后的豬0型口蹄疫病毒結 構蛋白VPl。
[0016] 本實用新型所述試劑盒采用酶聯(lián)免疫間接法制備，具體工藝如下：
[0017] 抗原包被反應板的制備：將純化的豬0型口蹄疫病毒重組結構蛋白VPl用包被緩 沖液稀釋成濃度為〇. 25~lug/ml的抗原包被液，包被緩沖液為0. 05mol/L、pH9. 6的碳酸鹽 緩沖液?；旌暇鶆蚝蠹尤?6孔酶標板內(nèi)，IOOul/孔。放置2~8°C過夜后，甩掉孔內(nèi)液體，以 洗滌液洗滌1次，洗滌液為20X濃縮洗滌液以純化水稀釋為IX洗滌液。甩干后，加入封 閉液，封閉液含5%。~10%。的魚明膠溶液，以150ul/孔加入，放置37°C恒溫箱中封閉2小時。 取出，甩去孔內(nèi)液體，干燥。
[0018] 樣本稀釋液：將1000 ml純化水中加入2. 8g磷酸二氫鉀、118g氯化鈉、Iml吐 溫-20、0. 2g硫柳汞鈉，加入5ml指示劑，定容至1000 ml并調節(jié)pH值為5~6,；按50ml/瓶 分裝。
[0019] 20 X濃縮洗滌液：將1000 ml純化水中加入4g磷酸二氫鉀、60g磷酸氫二鈉、IOml 吐溫-20、160g氯化鈉、4g氯化鉀，調節(jié)pH值為7. 0~7. 4,定容至1000 ml ;按50ml/瓶分裝
[0020] 酶標記物：將0· 6g Tris、2. 2g氯化鈉、0· 4ml濃鹽酸、0· 125g吐溫-20、(X Ig氨基 比林、0. 5ml Proclin300、2ml紅色染色劑加入到純化水中，最終定容至1000 ml并調節(jié)pH為 7. 0~7. 4,加入IOOul羊抗豬酶標記物；按22ml/瓶分裝。
[0021] 陽性對照血清：將豬0型口蹄疫病毒抗體陽性血清5ml、