肌鈣蛋白i、腦鈉肽、d-二聚體定量聯(lián)檢試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領(lǐng)域，具體涉及一種高靈敏度肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D- 二聚體定量聯(lián)檢試紙條。
【背景技術(shù)】
[0002]心肌肌I丐蛋白I (Cardiac troponin I，cTnl)是分子量22.5kD的心肌蛋白，和肌鈣蛋白T(TnT)，肌鈣蛋白C(TnC) —起，形成肌鈣蛋白復合體，從而對細胞內(nèi)鈣離子信號的傳遞和肌動-肌球蛋白的相互作用起著極其主要的作用，是一種高靈敏度、高特異性的心肌損傷的標志物。1987年英國Cummins等首先報告了測定周圍血中心肌肌I丐蛋白濃度來診斷急性心肌梗死(AMI)，引起了研究者們的廣泛注意，近年來關(guān)于心肌肌鈣蛋白的研究初步表明，心肌肌鈣蛋白I(cTnl)是心臟的特異性抗原，其釋放入血循環(huán)是心肌細胞損傷的敏感和高度特異性標志，對某些心血管病的診斷、預告及療效判斷等具有重要意義。1955年美國FDA批準cTnl作為AMI的最新試驗診斷指標。1999年和2000年世界生化檢測標準化協(xié)會、歐洲心臟病協(xié)會和美國心臟病學會提出了新的AMI定義和診斷標準，把血清標志物檢測，特別是肌鈣蛋白，放在了特別重要的位置。2001年11月美國心臟病學會和心臟病協(xié)會提出測定cTnl作為診斷AMI和急性冠狀動脈綜合癥危險分層的第一位標準。在人類心肌損傷的診斷中，cTnl已經(jīng)成為“金標準”之一。與其他指標相比，cTnl具有在血中出現(xiàn)時間早、持續(xù)時間長，且為心肌細胞所特有的優(yōu)點，所以心肌肌鈣蛋白I在臨床上有著廣泛應用的前景。
[0003]1988年日本學者Tetsuji Sudoh首次從豬腦內(nèi)分離得到一種具有強力的利鈉、利尿、擴血管和降壓作用的多肽，命名為腦鈉肽(brain natriuretic peptide，BNP)。以后的研究表明，不只是BNP這一種多肽，而是有一組多肽在生物進化的過程中逐漸發(fā)展產(chǎn)生(在人類和脊椎動物至少包括ANP、BNP、CNP、DNP、VNP和Urodilatin)，稱為利鈉肽(NP)家族。其功能是維持循環(huán)系統(tǒng)的容量、滲透壓和壓力調(diào)節(jié)的穩(wěn)態(tài)。目前用于臨床檢測的包括BNP和氨基末端腦鈉肽前體(NT-proBNP)兩種。在心肌細胞受刺激后，產(chǎn)生初始基因產(chǎn)物前BNP前體(pre-proBNP)，該肽的一個26氨基信號肽被立即去除，形成含108個氨基酸的的BNP前體(proBNP)，后者在內(nèi)切酶的作用下裂解為含有76個氨基酸、無生物活性的NT-proBNP和含有32個氨基酸、有活性的BNP。BNP主要來源是心室。在正常狀態(tài)下，BNP在顆粒中儲存很少，機械性刺激是心室產(chǎn)生及分泌BNP的主要原因。當各種心肌損傷引起心輸出量下降時，反饋性的興奮神經(jīng)、體液機制，從而使血管收縮、水鈉潴留、心臟前后負荷增加，心肌張力升高，心肌細胞受到牽拉，使心室肌細胞BNP合成與分泌增加，血漿BNP濃度升高?？梢援a(chǎn)生抑制腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)、抑制交感神經(jīng)活動、減少水鈉潴留、舒張血管等作用，對心臟有保護作用。因而血液BNP水平的異常變化即可以顯示心臟功能的變化。BNP對心衰的檢測價值近年來已被廣泛接受，現(xiàn)在認為BNP是心衰患者非常有力的診斷和預后的標志物，BNP的檢測也為心功能的分級提供了更加可靠的依據(jù)。Wieczorek SJ等比較測定了嚴格按美國紐約心臟病協(xié)會(NYHA)心功能分級標準診斷的慢性心衰(CHF)患者血漿BNP水平，心功能I?IV級CHF患者血液BNP濃度均值較正常人明顯增加，且隨心功能的損害程度加重呈顯著上升趨勢。若以100pg/ml為cut off值，BNP對CHF的診斷效能是??敏感度90%，特異性76%。BNP濃度值對于心衰患者的治療效果監(jiān)測也有幫助，治療有效的患者血液BNP水平較治療前明顯降低。
[0004]D- 二聚體(D-Dimer，簡稱DD)是交聯(lián)纖維蛋白的特異降解產(chǎn)物之一，分子量大小約為190kDa，在體內(nèi)半衰期> 3小時，主要經(jīng)腎臟排泄。人體纖溶系統(tǒng)對保持血管壁的正常通透性，維持血液的流動狀態(tài)和組織修復起著重要作用。正常人纖溶酶和抑制酶之間保持動態(tài)平衡，使血液循環(huán)能正常進行。機體發(fā)生凝血時，凝血酶作用于纖維蛋白原，轉(zhuǎn)變?yōu)榻宦?lián)纖維蛋白，同時纖溶系統(tǒng)被激活，交聯(lián)纖維蛋白溶解過程開始，纖溶酶降解纖維蛋白凝結(jié)塊形成各種可溶片段，形成纖維蛋白產(chǎn)物(FDPs)，包括X-寡聚體(X-oligomer)、D-二聚體(D-Dimer)、中間片段(Intermediate fragments)、片段 E (Fragment E)組成。其中，X-寡聚體和D-聚體均含D- 二聚體單位，其中最小、最簡單的降解終產(chǎn)物即是D- 二聚體。1971年Wilson等首先應用纖維蛋白降解產(chǎn)物用于診斷肺動脈栓塞(PE)。隨著研究的開展和深入，臨床工作者對D- 二聚體在肺動脈栓塞中的意義認識日益深刻。1999年歐洲心臟病學會急性肺動脈栓塞診斷和治療指南中推薦用ELISA方法檢測D- 二聚體。陰性的D- 二聚體值對于肺動脈栓塞具有理想的陰性預告作用，陰性的結(jié)果可以基本排除肺動脈栓塞，從而可以減少有創(chuàng)的檢查。但是臨床醫(yī)生必須清楚它的局限性和應用的指證。D-二聚體的濃度和血栓的位置有關(guān)，在肺動脈干主要分支的濃度較高，而在次要分支的濃度較低。在大分支的敏感性為93 %，小分支的敏感性為50 %。雖然D- 二聚體對于小分支血栓的診斷意義不夠明顯，然而其他檢查對于小的血栓同樣不明確，如肺動脈造影等。對于這些小的血栓，只要D-二聚體是陰性的，在患者心肺儲備功能比較好的情況下，可以不采取抗凝治療，臨床隨訪的結(jié)果表明這樣做是安全的。D-二聚體在深靜脈血栓(DVT)中總的診斷價值和在PE中的診斷類似價值，陰性的D-二聚體可以基本排除DVT形成的可能。陽性的結(jié)果意義不大，特異性不夠強，很多疾病可以引起D- 二聚體的升高。D- 二聚體在DVT診斷中的敏感性為95%，特異性為40%，陽性預測值為48%，陰性預測值為95%。
[0005]綜上所述，cTn1、BNP、DD幾種標志物的臨床診斷價值各不相同，可以從不同的方面反應心肺功能，三項聯(lián)合檢測可用于心肺疾病的輔助診斷。
[0006]目前國內(nèi)市場上暫無同類產(chǎn)品。
[0007]生物素-親和素系統(tǒng)(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫(yī)學各領(lǐng)域。將該系統(tǒng)應用于免疫組化，酶聯(lián)免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術(shù)中，可顯著地提高以上技術(shù)方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進行大規(guī)模流行病學調(diào)查，成為研究免疫反應的有力工具。由于BAS檢測系統(tǒng)經(jīng)濟快速，又無放射物質(zhì)污染，不需復雜儀器，充分顯示了此系統(tǒng)的巨大潛力和應用的可能性。
[0008]生物素-親和素系統(tǒng)檢測原理:BAS是在常規(guī)ELISA原理的基礎(chǔ)上，結(jié)合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達K^M1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學特性的一種蛋白質(zhì)，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個生物素，因幾乎所有用于標記的物質(zhì)均可以同親和素或鏈霉親合素結(jié)合。利用生物素-親和素系統(tǒng)研制肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D- 二聚體定量聯(lián)檢快速診斷試劑尚無報道。
【實用新型內(nèi)容】
[0009]本實用新型的目的，在于提供一種肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D-二聚體定量聯(lián)檢試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側(cè)向?qū)游龊蜕锼?鏈霉親和素放大系統(tǒng)，提供高靈敏度肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D-二聚體定量聯(lián)檢試紙條。使用本實用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩(wěn)定性，降低了非特異性結(jié)合，聯(lián)合檢測大幅度提高檢測的準確性和便利性，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0010]本實用新型解決其技術(shù)問題的解決方案是:肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D-二聚體定量聯(lián)檢試紙條，其包括底板，所述底板上依次設(shè)有樣品墊、熒光標記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標記物結(jié)合墊上，所述熒光標記物結(jié)合墊上固定有生物素標記的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、生物素標記的腦鈉肽單克隆抗體、生物素標記的D- 二聚體單克隆抗體和鏈霉親和素標記的熒光蛋白；所述檢測區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識別心肌肌鈣蛋白I另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的第一檢測線、識別腦鈉肽另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的第二檢測線、識別D- 二聚體另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的第三檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
[0011]作為上述技術(shù)方案的進一步改進，所述熒光標記物結(jié)合墊包括層疊的第一熒光標記物結(jié)合墊和第二熒光標記物結(jié)合墊，所述第一熒光標記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0012]作為上述技術(shù)方案的進一步改進，所述第一熒光標記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設(shè)有定位條，所述樣品墊的下端面設(shè)有能容納定位條的定位槽。
[0013]作為上述技術(shù)方案的進一步改進，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對應于硝酸纖維膜的位置設(shè)有觀察窗，卡殼殼面上對應于樣品墊的位置設(shè)有加樣孔。
[0014]作為上述技術(shù)方案的進一步改進，所述觀察窗為長方形孔。
[0015]作為上述技術(shù)方案的進一步改進，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0016]作為上述技術(shù)方案的進一步改進，所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。
[0017]作為上述技術(shù)方案的進一步改進，所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0018]作為上述技術(shù)方案的進一步改進，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0019]本實用新型與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下優(yōu)點:
[0020](1)本實用新型將熒光蛋白作為標記物，此標記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測穩(wěn)定性。
[0021](2)本實用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結(jié)合，有利于提高試劑盒性能。
[0022](3)利用本實用新型進行心肌肌鈣蛋白1、腦鈉肽、D-二聚體的檢測時間不大于10分鐘，心肌肌I丐蛋白I檢