肌鈣蛋白i、髓過氧化物酶定量聯(lián)檢試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型屬于免疫檢測領域，具體涉及一種高靈敏度心肌肌鈣蛋白1、髓過氧化物酶定量聯(lián)檢試紙條。
【背景技術】
[0002]心肌肌I丐蛋白I (Cardiac troponin I，cTnl)是分子量22.5kD的心肌蛋白，和肌鈣蛋白T(TnT)，肌鈣蛋白C(TnC) —起，形成肌鈣蛋白復合體，從而對細胞內(nèi)鈣離子信號的傳遞和肌動-肌球蛋白的相互作用起著極其主要的作用，是一種高靈敏度、高特異性的心肌損傷的標志物，已廣泛應用于急性缺血性心臟病心肌損傷的診斷、病情檢測和預后判斷。近年來關于心肌肌鈣蛋白的研究初步表明，cTnl是心臟的特異性抗原，其釋放入血循環(huán)是心肌細胞損傷的敏感和高度特異性標志，對某些心血管病的診斷、預告及療效判斷等具有重要意義。與其他指標相比，cTnl具有在血中出現(xiàn)時間早、持續(xù)時間長，且為心肌細胞所特有的優(yōu)點，所以心肌肌鈣蛋白I在臨床上有著廣泛應用的前景。2001年11月美國心臟病學會和心臟病協(xié)會提出測定cTnl作為診斷AMI和急性冠狀動脈綜合癥危險分層的第一位標準。在人類心肌損傷的診斷中，cTnl已經(jīng)成為“金標準”之一。
[0003]髓過氧化物酶(Myeloperoxidase，ΜΡ0)又稱為過氧化酶，是一種重要的含鐵溶酶體，存在于髓系細胞(主要是中性粒細胞和單核細胞)的嗜天青顆粒中，是髓細胞的特異性標志。人們于1967年第一次認識到ΜΡ0是對外來入侵發(fā)生固有免疫反應的組成成分。ΜΡ0是一種血色素蛋白，分子量為118kD，含有一對重鏈和輕鏈，它是在粒細胞進入循環(huán)之前在骨髓內(nèi)合成并存在于嗜天青顆粒內(nèi)，外界刺激可導致中性粒細胞聚集，釋放ΜΡΟ。ΜΡ0參與多種疾病的發(fā)生，如:炎癥、多發(fā)性硬化、血管炎和動脈粥樣硬化等。在特定條件下，ΜΡ0催化反應生成過量的氧化劑，超過局部抗氧化劑的防御反應時，就會導致氧化應激和氧化性組織損傷，ΜΡ0通過多種途徑調(diào)節(jié)炎癥反應，最重要的是通過調(diào)節(jié)一氧化氮對血管信號傳遞和舒張的作用，直接改變血管的炎癥反應性。
[0004]冠心病(coronary heart disease，CHD)是冠狀動脈發(fā)生粥樣硬化，發(fā)生痙攣、斑塊破裂及血栓形成導致管腔阻塞，引起冠狀動脈供血不足、心肌缺血或梗死的疾病。研究發(fā)現(xiàn)，從穩(wěn)定性心絞痛(SAP)發(fā)展到不穩(wěn)定性心絞痛(UAP)、再從UAP發(fā)展到急性心肌梗死(AMI)是由輕到重的連續(xù)變化病理過程，CHD不同病理階段，其動脈粥樣斑塊具有不同的病理特征。研究證實，炎癥反應在動脈粥樣硬化的所有階段均具有重要作用，從脂質(zhì)條紋形成到易損斑塊破裂。炎性細胞在動脈粥樣硬化早期病變中起支配地位，其效應分子加速病變進展，引起炎癥激活導致易損斑塊破裂，引發(fā)ACS。越來越多的臨床研究證據(jù)顯示，冠心病病理事件與血清炎癥標志物變化緊密相關，炎癥標志物在冠心病診斷、危險分層、治療及預測中均有重要價值。ΜΡ0是白細胞的功能和激活標志，為中性粒細胞、巨噬細胞分泌的含血紅互輔基的血紅素蛋白酶。臨床和流行病學研究發(fā)現(xiàn)，ΜΡ0廣泛參與動脈粥樣硬化的病理過程。Zhang等最早發(fā)現(xiàn)冠心病患者ΜΡ0水平高于對照組。Wainstein等進一步研究表明ΜΡ0與CHD嚴重程度相關，在不穩(wěn)定斑塊在大量中性粒細胞和世噬細胞浸潤及炎性因子表達。
[0005]綜上所述，cTn1、MP0的臨床診斷價值各不相同，ΜΡ0反映CHD不同病理階段，cTnl提示心肌損傷程度，兩者聯(lián)合檢測可較好地鑒別和診斷CHD不同病理階段，有助于CHD的危險分層，還可以更及時準確診斷心臟狀況，可用于心血管疾病的輔助診斷。
[0006]目前國內(nèi)市場上暫無同類產(chǎn)品。
[0007]生物素-親和素系統(tǒng)(b1tinavidin system，BAS)，是一種新型生物反應放大系統(tǒng)。隨著各種生物素衍生物的問世，BAS很快被廣泛應用于醫(yī)學各領域。將該系統(tǒng)應用于免疫組化，酶聯(lián)免疫，熒光免疫，放射免疫等檢測技術中，可顯著地提高以上技術方法的敏感性、特異性和穩(wěn)定性，使方法更簡便，有助于臨床快速診斷，并利于進行大規(guī)模流行病學調(diào)查，成為研究免疫反應的有力工具。由于BAS檢測系統(tǒng)經(jīng)濟快速，又無放射物質(zhì)污染，不需復雜儀器，充分顯示了此系統(tǒng)的巨大潛力和應用的可能性。
[0008]生物素-親和素系統(tǒng)檢測原理:BAS是在常規(guī)ELISA原理的基礎上，結(jié)合生物素與親和素間的高度放大作用，而建立的一種檢測系統(tǒng)。親和素是卵白蛋白中提取的一種堿性糖蛋白，分子量為68kDa，由4個亞單位組成，對生物素有非常高的親和力(結(jié)合常數(shù)高達K^M1)。生物素很易與蛋白質(zhì)(如抗體等)以共價鍵結(jié)合。這樣，結(jié)合了酶的親和素分子與結(jié)合有特異性抗體的生物素分子產(chǎn)生反應，既起到了多級放大作用，又由于酶在遇到相應底物時的催化作用而呈色，達到檢測未知抗原(或抗體)分子的目的。鏈霉親和素是與親和素有相似生物學特性的一種蛋白質(zhì)，鏈霉親和素與親和素一樣分子中每條肽鏈都能結(jié)合一個生物素，因幾乎所有用于標記的物質(zhì)均可以同親和素或鏈霉親合素結(jié)合。利用生物素-親和素系統(tǒng)研制肌鈣蛋白1、髓過氧化物酶定量聯(lián)檢快速診斷試劑尚無報道。
【實用新型內(nèi)容】
[0009]本實用新型的目的，在于提供一種肌鈣蛋白1、髓過氧化物酶定量聯(lián)檢試紙條，其基于雙抗體夾心法、熒光免疫側(cè)向?qū)游龊蜕锼?鏈霉親和素放大系統(tǒng)，提供高靈敏度心肌肌鈣蛋白1、髓過氧化物酶定量聯(lián)檢試紙條。使用本實用新型時，提高了檢測靈敏度和檢測穩(wěn)定性，降低了非特異性結(jié)合，聯(lián)合檢測大幅度提高檢測的準確性和便利性，檢測時間不大于10分鐘，大大提高了診斷效率。
[0010]本實用新型解決其技術問題的解決方案是:肌鈣蛋白1、髓過氧化物酶定量聯(lián)檢試紙條，其包括底板，所述底板上依次設有樣品墊、熒光標記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述吸水墊和熒光標記物結(jié)合墊分別交疊壓在硝酸纖維素膜的兩端后在硝酸纖維素膜的表面形成檢測區(qū)，所述樣品墊交疊壓在熒光標記物結(jié)合墊上，所述熒光標記物結(jié)合墊上固定有生物素標記的心肌肌鈣蛋白I單克隆抗體、生物素標記的髓過氧化物酶單克隆抗體和鏈霉親和素標記的熒光蛋白；所述檢測區(qū)內(nèi)的硝酸纖維素膜上固定有識別心肌肌鈣蛋白I另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的第一檢測線、識別髓過氧化物酶另外一個表位的單克隆抗體構(gòu)成的第二檢測線和羊抗鼠IgG多克隆抗體構(gòu)成的質(zhì)控線。
[0011]作為上述技術方案的進一步改進，所述熒光標記物結(jié)合墊包括層疊的第一熒光標記物結(jié)合墊和第二熒光標記物結(jié)合墊，所述第一熒光標記物結(jié)合墊的一端墊在樣品墊的下方，所述第二熒光標記物結(jié)合墊交疊壓在硝酸纖維素膜的一端。
[0012]作為上述技術方案的進一步改進，所述第一熒光標記物結(jié)合墊中插入樣品墊下方的一端設有定位條，所述樣品墊的下端面設有能容納定位條的定位槽。
[0013]作為上述技術方案的進一步改進，還包括卡殼，所述底板、樣品墊、熒光標記物結(jié)合墊、硝酸纖維素膜和吸水墊均置于卡殼內(nèi)，所述卡殼殼面上對應于硝酸纖維膜的位置設有觀察窗，卡殼殼面上對應于樣品墊的位置設有加樣孔。
[0014]作為上述技術方案的進一步改進，所述觀察窗為長方形孔。
[0015]作為上述技術方案的進一步改進，所述熒光蛋白可以是綠色熒光蛋白、藻膽蛋白中的一種。
[0016]作為上述技術方案的進一步改進，所述樣品墊為經(jīng)表面活性劑緩沖液浸泡處理后干燥的玻璃纖維構(gòu)件。
[0017]作為上述技術方案的進一步改進，所述底板為聚苯乙烯構(gòu)件或者聚乙烯構(gòu)件。
[0018]作為上述技術方案的進一步改進，所述卡殼包括塑料上殼和塑料下殼，所述塑料上殼扣合塑料下殼上后形成卡殼。
[0019]本實用新型與現(xiàn)有技術相比，具有如下優(yōu)點:
[0020](1)本實用新型將熒光蛋白作為標記物，此標記物穩(wěn)定性良好，有利于提高檢測穩(wěn)定性。
[0021](2)本實用新型通過利用“鏈霉親和素-生物素放大系統(tǒng)”，提高檢測靈敏度，降低非特異性結(jié)合，有利于提高試劑盒性能。
[0022](3)利用本實用新型進行心肌肌鈣蛋白1、髓過氧化物酶的檢測時間不大于10分鐘，心肌肌鈣蛋白I檢測線性范圍為0.05-30.00ng/mL，髓過氧化物酶檢測線性范圍為50.0-8000.0pmol/L，極大地提高了檢測效率。
[0023](4)本實用新型可通過熒光免疫分析儀對結(jié)果進行判讀，可實現(xiàn)自動化，減少主觀因素的影響，提供便利、快速、可靠的診斷結(jié)果。
[0024](5)本實用新型卡殼設有樣品進入的加樣孔和供觀測結(jié)果的觀察窗，根據(jù)分析儀器判定結(jié)果，準確可靠。
[0025](6)本實用新型制作方便，體積小、便于攜帶。
[0026](7)本實用新型檢測成本較低。
[0027](8)本實用新型可批量生產(chǎn)，適用于臨床快速診斷和現(xiàn)場快速診斷；易于保存，有利于基層單位推廣。
[0028](9)本實用新型采用聯(lián)合檢測，一條檢測條同時檢測兩項，檢測更加方便。
【附圖說明】
[0029]為了更清楚