一種空腸彎曲菌免疫膠體金快速檢測試紙條的制作方法
【技術領域】
[0001] 本實用新型屬于生物工程領域，尤其涉及一種空腸彎曲菌，具體來說是一種空腸 彎曲菌免疫膠體金快速檢測試紙條。
【背景技術】
[0002] 空腸彎曲菌（Campylobacterjejunienteritis)是 1973 年Butzler等自腹瀉病 人糞便中分離出來，目前已認識其為人類腹瀉的主要致病菌之一?？漳c彎曲菌腸炎的發(fā)病 率在發(fā)達國家超過細菌性痢疾，在發(fā)展中國家發(fā)病率幾乎等同于細菌性痢疾。本菌作為重 要的食源性致病菌，隨著食物進入腸道后在含微量氧環(huán)境下迅速繁殖，主要侵犯空腸、回腸 和結(jié)腸，侵襲腸粘膜，造成充血及出血性損傷，近年來觀察到有些菌株能產(chǎn)生類似霍亂腸毒 素，引起腸腔內(nèi)液體分泌增加。
[0003] 目前空腸彎曲菌的檢測主要依賴于國標所規(guī)定的生化鑒定，其缺點是操作繁瑣、 檢測周期較長，無法適應大量的樣品篩查。免疫學檢測是近年來出現(xiàn)的最快速、準確、穩(wěn)定 的快速檢測手段，但國內(nèi)外目前尚無可運用于檢測實踐的快速檢測產(chǎn)品。 【實用新型內(nèi)容】
[0004] 針對現(xiàn)有技術中的上述技術問題，本實用新型提供了一種空腸彎曲菌免疫膠體金 快速檢測試紙條，所述的這種空腸彎曲菌免疫膠體金快速檢測試紙條解決了現(xiàn)有技術中檢 測空腸彎曲菌操作復雜，周期長的技術問題。
[0005] 本實用新型提供了一種空腸彎曲菌免疫膠體金檢測試紙條，其特征在于：包括樣 品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊，所述的樣品墊和所述的金標墊緊密相連，所述的金 標墊和所述的硝酸纖維素膜緊密相連，所述的硝酸纖維素膜和所述的吸水墊緊密相連，在 所述的硝酸纖維素膜上設置有檢測線，所述的檢測線接近所述的金標墊，所述的檢測線遠 離所述的金標墊的一側(cè)的硝酸纖維素膜上設置有質(zhì)控線，由抗空腸彎曲菌單克隆抗體和膠 體金結(jié)合后形成金標抗體，所述的金標抗體噴涂于結(jié)合墊上形成金標墊，由抗空腸彎曲菌 單克隆抗體作為檢測抗體，所述的檢測抗體噴涂于硝酸纖維素膜上形成檢測線。
[0006] 在一優(yōu)選例中，所述的質(zhì)控線由羊抗兔抗體或者羊抗鼠抗體組成。
[0007] 在另一優(yōu)選例中，所述的樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜和吸水墊設置在一個底板 上。
【附圖說明】
[0008] 圖1是本實用新型實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的單抗 SDS-PAGE電泳圖；
[0009] 圖2是本實用新型實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的各抗體偶聯(lián) 膠體金pH結(jié)果；
[0010] 圖3是本實用新型實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的各抗體偶聯(lián) 膠體金結(jié)合量結(jié)果；
[0011] 圖4是本實用新型實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的結(jié)構示意圖；
[0012] 圖5是本實用新型實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的不同抗體組 合結(jié)果；
[0013] 圖6是本實用新型實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的膠體金試紙 條靈敏度結(jié)果；
[0014] 圖7是本實用新型實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的膠體金試紙 條交叉反應結(jié)果；
[0015] 圖8是本實用新型實施例中空腸彎曲菌的免疫膠體金檢測試紙條的模擬帶菌結(jié) 果。
【具體實施方式】
[0016] 本實用新型的檢測原理與結(jié)果判斷過程為：若樣本中有待測細菌，測定時樣品處 理液加在樣品墊上，樣品處理液按樣品墊、金標墊、硝酸纖維素膜、吸水墊的方向移動，流經(jīng) 金標墊時，使金標墊上的與膠體金耦聯(lián)的單克隆抗體復溶，并帶動其向硝酸纖維素膜、吸水 墊移動，與膠體金耦聯(lián)的單克隆抗體可與樣品中的細菌結(jié)合，形成免疫復合物，此免疫復合 物流至檢測線時，即被檢測線的單克隆抗體所捕獲，形成細菌+金標抗體+抗體的復合體， 在硝酸纖維素膜上的檢測線位置顯出紅色檢測線條；此免疫復合物流經(jīng)質(zhì)控線時，即被質(zhì) 控線的固相抗體所捕獲，在硝酸纖維素膜上的質(zhì)控線位置顯出紅色質(zhì)控線條。陽性標本既 顯示檢測線，又顯示質(zhì)控線；陰性標本沒有檢測線，僅顯示質(zhì)控線。
[0017] 本實用新型的與膠體金耦聯(lián)的單克隆抗體由保藏號為CGMCCN0. 8457的雜交瘤細 胞株分泌產(chǎn)生，所述的檢測線的單克隆抗體由保藏號為CGMCCN0. 8766的雜交瘤細胞株分 泌產(chǎn)生。
[0018] 本實用新型包括具有與抗空腸彎曲菌單克隆抗體4C9E1G7H3、3G2D8H3G9的相應 氨基酸序列的單克隆抗體，以及具有這些鏈的其他蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn) 物。具體地，本實用新型包括具有含超變區(qū)（互補決定區(qū)，CDR)的輕鏈和重鏈的任何蛋白 質(zhì)或蛋白質(zhì)偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物（即免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物），只要該超變區(qū)與本 實用新型的輕鏈和重鏈的超變區(qū)相同或至少90%同源性，較佳地至少95%同源性。如本領 域技術人員所知，免疫偶聯(lián)物及融合表達產(chǎn)物包括：藥物、毒素、細胞因子（cytokine)、放 射性核素、酶和其他診斷或治療分子與抗空腸彎曲菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的而形成的 偶聯(lián)物。本實用新型還包括與抗空腸彎曲菌單克隆抗體或其片段結(jié)合的細胞表面標記物或 抗原。
[0019] 對于本實用新型的抗空腸彎曲菌單克隆抗體重鏈和輕鏈序列，可以用常規(guī)方法測 定?？箍漳c彎曲菌單克隆抗體V鏈的超變區(qū)或互補決定區(qū)（complementaritydetermining region，CDR)特別令人感興趣，因為它們中至少部分涉及結(jié)合抗原。因此，本實用新型包括 那些具有帶CDR的免疫球蛋白輕鏈和重鏈可變鏈的分子，只要其CDR與抗空腸彎曲菌單克 隆抗體CDR具有90%以上（較佳地95%以上）的同源性。本實用新型不僅包括完整的單 克隆抗體，還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab或（Fab')2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈。
[0020] 本實用新型還提供了上述免疫球蛋白或其片段的DNA分子。這些DNA分子的序列 可以用常規(guī)技術，利用雜交瘤細胞系（CGMCCNo. 8457)或（CGMCCNo. 8766)獲得。此外，還 可將輕鏈和重鏈的編碼序列融合在一起，形成單鏈抗體。
[0021] -旦獲得了有關的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關序列。這通常是將 其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細胞中分離得到有關序列。
[0022] 此外，還可用人工合成的方法來合成有關序列，尤其是片段長度較短時。通常，通 過先合成多個小片段，然后再進行連接可獲得序列很長的片段。
[0023]目前，已經(jīng)可以完全通過化學合成來得到編碼本實用新型蛋白（或其片段，或其 衍生物）的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領域中己知的各種現(xiàn)有的DNA分子（或 如載體）和細胞中。此外，還可通過化學合成將突變引入本實用新型蛋白序列中。
[0024] 本實用新型還涉及包含上述的適當DNA序列以及適當啟動子或者控制序列的載 體。這些載體可以用于轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，以使其能夠表達蛋白質(zhì)。
[0025] 宿主細胞可以是原核細胞，如細菌細胞；或是低等真核細胞，如酵母細胞；或是高 等真核細胞，如哺乳動物細胞。
[0026] 用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細胞可用本領域技術人員熟知的常規(guī)技術進行。當宿主為原 核生物如出血性大腸桿菌時，能吸收DNA的感受態(tài)細胞可在指數(shù)生長期后收獲，用CaClJi 處理，所用的步驟在本領域眾所周知。另一種方法是使用MgCl2。如果需要，轉(zhuǎn)化也可用電 穿孔的方法進行。當宿主是真核生物，可運用如下的DNA轉(zhuǎn)染方法：磷酸鈣共沉淀法，常規(guī) 機械方法如顯微注射、電穿孔，脂質(zhì)體包裝等。
[0027] 獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，表達本實用新型的基因所編碼的多肽。根據(jù) 所用的宿主細胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細胞生長的條 件下進行培養(yǎng)。當宿主細胞生長到適當?shù)募毎芏群螅煤线m的方法（如溫度轉(zhuǎn)換或化學 誘導）誘導選擇的啟動子，將細胞再培養(yǎng)一段時間。
[0028] 在上面的方法中的重組多肽可在細胞內(nèi)、或在細胞膜上表達、或分泌到細胞外。如 果需要，可利用其物理的、化學的和其它特性通過各種分離方法分離和純化重組的蛋白。這 些方法是本領域技術人員所熟知的。這些方法的例子包括但并不限于：常規(guī)的復性處理、 用蛋白沉淀劑處理（鹽析方法）、離心、滲透破菌、超聲處理、超離心、分子篩層析（凝膠過 濾）、吸附層析、離子交換層析、高效液相層析（HPLC)和其它各種液相層析技術及這些方法 的結(jié)合。
[0029] 本實用新型的抗抗空腸彎曲菌單克隆抗體4C9E1G7H3、3G2D8H3G9,其效價高（可 以達到1:100000)，能夠特異性地、高效地檢測空腸彎曲菌，與出血性大腸桿菌0157:H7、陰 溝腸桿菌、糞腸球菌、大腸埃希氏菌、單增李斯特菌、伊氏李斯特氏菌、鼠傷寒沙門氏菌、甲 型副傷寒沙門氏菌、火雞沙門氏菌、宋內(nèi)氏志賀、福氏志賀氏菌、阪崎腸桿菌、蠟樣芽孢桿 菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、鼠李糖乳桿菌等共計91種病原細菌均無交叉反應，此 為本實用新型的最大創(chuàng)新點。上述單克隆抗體3G2D8H3G9可以用辣根過氧化物酶、堿性磷 酸酯酶、納米金顆粒標記，專一性地作為檢測抗體使用。
[0030] 本實用新型和已有技術相比較，其技術進步是顯著的。本實用新型由于采用了新 篩選的配對單克隆抗體分別噴涂金標墊和檢測線，實驗結(jié)果對空腸彎曲菌的檢測特異性和 靈敏性均較高。
[0031] 以下結(jié)合附圖介紹本實用新型的具體實施例：
[0032] 首先介紹本實用新型實施例中所使用的試劑與儀器：
[0033] 主要試劑
[0034] 弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑、PEG、TWEEN-20Sigma;BSA購于上海世澤生物 科技有限公司；膠體金溶液購于上海金標生物科技有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）135S Millipore;羊抗鼠、HRP-羊抗鼠、羊抗兔購于上