一種用于檢測乳腺癌細(xì)胞的染色試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，具體地涉及一種用于檢測乳腺癌細(xì)胞的染色試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]乳腺癌患者遠(yuǎn)期生存的評價(jià)指標(biāo)，包括原發(fā)灶的大小、腋窩淋巴結(jié)有無轉(zhuǎn)移、腫瘤分子分型、以及是否有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的證據(jù)等，這些指標(biāo)對于患者群體的生存評價(jià)非常有意義，但對某些個(gè)體患者的風(fēng)險(xiǎn)判斷的準(zhǔn)確性相對有限。此外，在乳腺癌的隨訪期是通過體格檢查、影像學(xué)等檢查進(jìn)行定期體檢，等這些檢查發(fā)現(xiàn)問題的時(shí)候其實(shí)已經(jīng)錯(cuò)過了治療的最佳時(shí)機(jī)。在乳腺癌的早期階段，就有相當(dāng)部分患者有微轉(zhuǎn)移病灶(無法被常規(guī)醫(yī)學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)的微小轉(zhuǎn)移病灶)。既往研究發(fā)現(xiàn)微轉(zhuǎn)移檢測能夠較目前隨訪檢查手段更早反映患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的情況，而且微轉(zhuǎn)移陽性患者較陰性患者預(yù)后更差。1979年，Heyderman通過免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry，ICC)的方法檢測到正常乳腺腺泡管腔膜上、乳腺癌細(xì)胞的細(xì)胞膜上和胞楽內(nèi)廣泛存在EMA (Epithelial Membrane Antigen)的表達(dá)。隨后，Sloane入組了 43位出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者，從髂嵴收集骨髓標(biāo)本加入EMA的抗體，通過ICC的方法首次發(fā)現(xiàn)有8位患者的骨髓標(biāo)本中存在轉(zhuǎn)移的單個(gè)腫瘤細(xì)胞和少量腫瘤細(xì)胞團(tuán)。這些腫瘤細(xì)胞從原發(fā)灶脫離之后，通過淋巴和/或血液循環(huán)播散至遠(yuǎn)處靶器官，潛伏在靶器官中，進(jìn)入休眠狀態(tài)，形成微轉(zhuǎn)移細(xì)胞/微轉(zhuǎn)移灶。當(dāng)機(jī)體內(nèi)環(huán)境改變或在某些外界因素的作用下，這些休眠的微轉(zhuǎn)移細(xì)胞開始重新增殖，最終形成臨床檢查可以發(fā)現(xiàn)的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移病灶。目前，臨床上通常將存在于血液系統(tǒng)的微轉(zhuǎn)移細(xì)胞稱為循環(huán)腫瘤細(xì)胞(Circulating TumorCell，CTC);定植于骨髓組織(Bone Marrow，BM)的則命名為播散腫瘤細(xì)胞(DisseminatedTumor Cell，DTC)0
[0003]如能提供一種簡單的方法檢測骨髓標(biāo)本或血液標(biāo)本中是否有乳腺癌微轉(zhuǎn)移細(xì)胞，對于乳腺癌的預(yù)后判斷和個(gè)體化治療具有重要意義。
【實(shí)用新型內(nèi)容】
[0004]實(shí)用新型目的:為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的問題，本實(shí)用新型提供一種操作簡便、準(zhǔn)確性好的用于檢測乳腺癌細(xì)胞的染色試劑盒。
[0005]技術(shù)方案:為實(shí)現(xiàn)上述技術(shù)目的，本實(shí)用新型的用于檢測乳腺癌細(xì)胞的染色試劑盒包括盒體、盒蓋、載玻片、裝有小鼠抗人廣譜細(xì)胞角蛋白抗體的一抗試劑瓶、裝有辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠抗體的二抗試劑瓶、DAB顯色試劑組、DAB顯色液儲瓶、裝有蘇木素的復(fù)染液試劑瓶、裝有1 %鹽酸乙醇的分色液試劑瓶、裝有中性樹膠的封片液試劑瓶，其中，所述的盒體包括上下兩層，其中，下層被分隔為兩個(gè)空腔，兩個(gè)空腔內(nèi)分別設(shè)置有可抽拉的抽屜，其中，所述的載玻片設(shè)置于其中一個(gè)空腔內(nèi)，所述的DAB顯色試劑組設(shè)置于另一個(gè)空腔內(nèi)；所述的DAB顯色試劑組包括裝有DAB緩沖液的試劑瓶、裝有DAB底物的試劑瓶和裝有DAB色原的試劑瓶；所述盒體的上層被分隔成六個(gè)分區(qū)，分別用于放置一抗試劑瓶、二抗試劑瓶、DAB顯色液儲瓶、復(fù)染液試劑瓶、分色液試劑瓶和封片液試劑瓶。
[0006]優(yōu)選地，所述的DAB顯色液儲瓶為棕色儲瓶。
[0007]優(yōu)選地，所述的可抽拉的抽屜外側(cè)設(shè)置有拉環(huán)。
[0008]使用方法:
[0009](1)制備表面平鋪細(xì)胞的載玻片面；
[0010](2)以小鼠抗人廣譜細(xì)胞角蛋白抗體(小鼠抗人Ant1-pan Cytokeratinantibody[AE1/AE3])為一抗，將其與步驟⑴得到的平鋪細(xì)胞的載玻片于37°C溫箱中孵育1?2h，PBS洗漆3?4次，每次3?4min ；
[0011](3)以辣根過氧化物酶標(biāo)記(HRP Polymer Conjugate)兔抗鼠抗體為二抗，將步驟⑵得到的載玻片與所述二抗于常溫下孵育25?30min，PBS洗滌3?4遍，每次3?4min ；
[0012](4)向步驟(3)得到的載玻片上滴加新鮮配制的DAB棕色顯色液，室溫下靜置5?8min，待在低倍鏡(10X)下視野內(nèi)細(xì)胞呈現(xiàn)棕色染色后用水洗滌終止反應(yīng)；
[0013](5)用蘇木素復(fù)染步驟(4)得到的載玻片30?40s，用自來水洗滌至水清澈后，用1%鹽酸乙醇分色ls，然后水浸洗1?1.5min，依次浸入85% (v/v)乙醇、95% (v/v)乙醇、無水酒精中各3?4min，最后浸沒到二甲苯中5?6min，從二甲苯中取出載玻片后風(fēng)干，在載玻片半干時(shí)，滴加中性樹膠封片液，封片保存，然后置于顯微鏡下觀察。
[0014]其中，表面平鋪乳腺癌細(xì)胞的載玻片的制備方法如下:
[0015]1)胰酶消化體外培養(yǎng)的乳腺癌細(xì)胞株，PBS溶液洗滌和混勻。
[0016]2)打開離心機(jī)，將含有乳腺癌細(xì)胞株的PBS加入樣本孔，使得每個(gè)樣本孔的總細(xì)胞量在0.2?0.5M個(gè)，優(yōu)選地，控制每個(gè)樣本孔的總細(xì)胞量為0.3M個(gè)，此時(shí)，細(xì)胞在載玻片上可以分布均勻，密度適中，便于鏡下觀察，過多時(shí)即會出現(xiàn)細(xì)胞重疊現(xiàn)象。離心后吸棄PBS溶液，得到表面平鋪乳腺癌細(xì)胞的載玻片；
[0017]3)將上述載玻片風(fēng)干后，丙酮固定8?lOmin ；
[0018]4)在組織周圍用免疫組化筆畫圈，圈線離組織3mm左右；
[0019]5)PBS洗滌3?4min，然后用3?5wt% H202室溫浸泡8?lOmin，最后用PBS洗滌3?4遍，每次3?4min即得。
[0020]其中，步驟⑵中，Hettich離心機(jī)離心的條件為2500?2800rcf，6?8min。
[0021]其中，步驟(4)中，所述的DAB棕色顯色液通過如下步驟制備:850ul去離子水中依次加入DAB顯色試劑盒(福建邁新，貨號DAB-0031)中的A液(DAB緩沖液)和B液(DAB底物)和C液(DAB色原)各50ul，混勻后避光備用。
[0022]步驟(5)中，所述的1%鹽酸乙醇通過如下方法配制:75% (v/v)的乙醇中加入36.5wt%?38界1:%濃鹽酸中，其中，75% (v/v)的乙醇與36.5wt%?38界1:%濃鹽酸的體積比為100: 1。
[0023]當(dāng)用于檢測血液樣品中的乳腺癌細(xì)胞時(shí)，步驟類似，不同的是，首先提取血液樣品中的單核細(xì)胞層細(xì)胞，然后制備表面平鋪細(xì)胞的載玻片。提取血液樣品中的單核細(xì)胞層細(xì)胞采用公知的方法，如包括下述步驟:
[0024](A):用肝素鈉抗凝管收集外周血標(biāo)本，離心，吸棄上層血漿，得到血細(xì)胞；
[0025](B):將步驟A得到的血細(xì)胞用PBS稀釋混勻后，加入預(yù)先放置了淋巴細(xì)胞分離液的離心管中，離心后取上清和淋巴細(xì)胞分離液之間的液體即為單核細(xì)胞層細(xì)胞，將所述單核細(xì)胞層細(xì)胞加入PBS溶液中洗滌，離心后加入PBS緩沖液混勻備用；
[0026]制備表面平鋪細(xì)胞的方法同上述制備表面平鋪乳腺癌細(xì)胞的步驟相同。
[0027]有益效果:本實(shí)用新型提供了一種用于檢測乳腺癌細(xì)胞的試劑盒，結(jié)構(gòu)簡單，使用方便，通過以小鼠抗人廣譜細(xì)胞角蛋白抗體(AE1/AE3)為一抗，以辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠抗體為二抗，通過DAB和蘇木素染色，使得血液中的乳腺癌細(xì)胞被特異性染色。本實(shí)用新型的方法操作簡單，準(zhǔn)確性好，具有較好的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0028]圖1為乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的染色效果圖。
[0029]圖2為含有乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的外周血染色效果圖(2A為含有MCF-7的外周血染色效果圖，2B為不含有MCF-7的外周血染色效果圖)。
[0030]圖3為含有乳腺癌細(xì)胞株MCF-7的骨髓血染色效果圖(3A為含有MCF-7的骨髓血染色效果圖，3B為不含有MCF-7的骨髓血染色效果圖)。
[0031]圖4為本實(shí)用新型的試劑盒的示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0032]本實(shí)用新型提供了一種用于檢測乳腺癌細(xì)胞的試劑盒，如圖4所示，包括盒體1、盒蓋2、載玻片、裝有小鼠抗人廣譜細(xì)胞角蛋白抗體的一抗試劑瓶3、裝有辣根過氧化物酶標(biāo)記兔抗鼠抗體的二抗試劑瓶4、DAB顯色試劑組、DAB顯色液儲瓶5、裝有蘇木素的復(fù)染液試劑瓶6、裝有1 %鹽酸乙醇的分色液試劑瓶7、裝有中性樹膠的封片液試劑瓶8，其中，盒體包括上下兩層，其中，下層被分隔為兩個(gè)空腔，兩個(gè)空腔內(nèi)分別設(shè)置有可抽拉的抽屜，每個(gè)抽屜外壁設(shè)置有拉環(huán)9，其中，載玻片設(shè)置于其中一個(gè)空腔內(nèi)，所述的DAB顯色試劑組設(shè)置于另一個(gè)空腔內(nèi)；DAB顯色試劑組包括裝有DAB緩沖液