基于磁微粒子的具有通道的光學微流控芯片的制作方法
【技術領域】
[0001]本實用新型涉及生物傳感器檢測技術領域，是采用微流控技術、免疫技術和納米磁粒子技術的一種基于磁微粒子的具有通道的光學微流控芯片。
【背景技術】
[0002]即時檢驗(point-of-caretesting，POCT)產品的發(fā)展經歷了采用試條試紙的第一代定性檢測，采用色板卡比色或半定量儀器閱讀的第二代半定量，采用手工操作的第三代全定量系統(tǒng)，以及采用自動化信息化智能化的第四代技術平臺。微流控(microf Iuidics)芯片是可以完成生物化學分析儀的微型芯片，可以實現(xiàn)對原有檢驗儀器微型化，制成便攜式儀器，用于床邊檢驗。
[0003]微流控技術是一種針對極小量流體進行操控的系統(tǒng)科學技術，是現(xiàn)代生物科學的一個重要信息采集和處理平臺，為生命領域研究提供技術支撐和操作平臺。微流控集成芯片不僅可以實現(xiàn)許多化學和一些傳統(tǒng)生物學實驗的自動化操作、檢測與分析，而且可以大大減小樣品、試劑和時間的消耗，極大地提高實驗的通量，減少實驗中廢棄物的產生。更重要的是，集成微流控芯片不僅僅是簡單地對傳統(tǒng)意義上的化學或生物學實驗進行微型化的集成，它還提供了一種全新的理念和技術平臺，使得原先在傳統(tǒng)的化學和生物學手段下很難完成或不能完成的某些實驗能夠得以順利地實現(xiàn)。疾病診斷和藥物研究隨著微流控芯片技術的不斷發(fā)展，漸漸發(fā)展成融合生物樣本處理純化、反應標記及檢測等多個實驗步驟的功能化生物芯片，從而擴大在疾病診斷和藥物研究等領域的應用。但是，由于很多集成芯片外部的控制設備過于復雜，芯片附屬的連接管道、移液附件、外置栗體等配件，大幅提高了芯片的費用，也使操作精細，難以在實驗室外的場地推廣應用。因此，需要設計制備不需要外加配件的集成芯片，簡化芯片的操作，實現(xiàn)便捷應用，從而實現(xiàn)微流控集成芯片商品化和實用化。
[0004]結合磁珠分離的免疫檢測技術，可以通過磁珠的分離效應，有效的捕捉到待測樣品中的低濃度待測樣品，結合熒光或者化學發(fā)光等檢測方式，使檢測靈敏度大幅度提高，通過磁場的轉換，磁粒子的運動增加了捕獲待測物的速度，檢測速度也可以大幅提高。但是，由于需要洗滌等步驟去處未結合的廢液，通常需要再進行緩沖液或者發(fā)光試劑等，需要多步驟操作，從而增加了檢測的復雜度，不能實現(xiàn)一步檢測，限制了檢測場地和應用領域；因此需要在結合微流控技術方面進行新的檢測方法等方面設計和優(yōu)化，從而實現(xiàn)便捷的POCT檢測。
[0005]S·F·Yang，B·Z·Gao，H·Y·Tsai and C.Bor Fuh，Detection of c-reactiveprotein based on a magnetic immunoassay by using functional magnetic andfluorescent nanoparticles in microplates，Analyst，2014，139，5576_5581 ·最新報道的集成微流控芯片，采用磁粒子焚光檢測方法實現(xiàn)c-反應蛋白（C-reactive protein,CRP)的高靈敏檢測（lyg/L?10mg/L) (IOpM?O. ΙμΜ)，但是需要采用微栗分步加入粒子和各種反應試劑，此外需要洗滌步驟，不能實現(xiàn)一步檢測。[000?] C反應蛋白（c-reactive protein，CRP)是第一個被認為是急性時相反應蛋白，正常情況下含量極微量，在急性創(chuàng)傷和感染時其血濃度急劇升高。CRP是臨床上最常用的急性時相反應指標。一般新生兒血清CRP水平小于2mg/L，大于此值即與細菌感染的嚴重程度有關;兒童和成人< 10mg/L; 10?99mg/L提示局灶CRP檢測對性或淺表性感染，> 100mg/L提示敗血癥或侵襲性感染等嚴重感染。于疾病的診斷無特異性，但其濃度上升是各種原因引起的炎癥和組織損傷的敏感指標。在感染發(fā)生后4?6h開始升高，24?48h達到高峰，，峰值可謂正常值的100?1000倍。在感染消除后其含量急劇下降，一周內可恢復正常。病毒感染時，CRP不增高（除了一些嚴重侵襲導致組織損傷的病毒如腺病毒、皰疹病毒等）。臨床上CRP—般作為鑒別細菌或病毒感染的一個首選指標，用于自身免疫性及感染性疾病的診斷和監(jiān)測、抗生素療效觀察、輔助診斷新生兒期感染性疾病、監(jiān)測病情變化以及術后感染等。超敏C反應蛋白（High sensitivity C-reactive protein)與CRP并不是兩種蛋白，其實是根據測定方法的敏感性而命名。研究表明，hs-CRP2 2.0mg/L是中國人發(fā)生心血管疾病的有效預測因子。與心血管疾病一樣，動脈粥樣硬化在腦血管病的發(fā)病中也起重要作用，血清hs-CRP不僅是腦血管意外的預測因子，也是預后與評價療效的指標之一。臨床常規(guī)測定普通CRP的方法檢測線性一般為3?200mg/L，因缺乏較高的靈敏性已不足以預測心血管事件的危險。近年相繼采用膠乳增強的免疫比濁法等技術大大提高了分析的靈敏度(檢測低限為0.005?0.10mg/L不等），在低濃度CRP(如0.15?10mg/L)測定范圍內有很高的準確度。用這些方法所進行測定的CRP稱為高敏感(1^811-86118；[1：；^；^50或超敏感(1111^386118；[1：；^6)0^。一般認為，我國健康人群hs-CRP水平的中位數范圍為0.58?1.13mg/L。多數研究認為hs-CRP在3mg/L以下，冠狀動脈事件發(fā)生危險較低。美國疾病控制預防中心（CDC)與美國心臟協(xié)會(AHA)建議，可根據hs-CRP水平對患者進行心血管病危險分類：S卩3. 0mg/L為高度危險。目前CRP檢測主要采用ELISA等方法，檢測步驟多；采用POCT方法，主要是膠體金試條，在量化檢測方面準確度不夠。因此，迫切需要檢測方便，準確度高的POCT產品。
[0007]為了實現(xiàn)樣品的快速靈敏便捷的檢測，在實現(xiàn)本實用新型的過程中，申請人發(fā)現(xiàn)上述現(xiàn)有技術存在如下技術缺陷：
[0008](I)無法實現(xiàn)一步式檢測，需要額外的加入試劑步驟，需要洗滌；這就無法實現(xiàn)POCT的應用;限制了應用場地和范圍。
[0009](2)多步檢測反應，在每步操作中增加了誤差，微栗進樣控制差異會導致檢測結果的偏差，并增加了檢測的復雜性。
[0010](3)微流控芯片缺少質控檢測步驟，對于抗體的失活與否沒有判定，容易導致漏檢。
【實用新型內容】
[0011](一)要解決的技術問題
[0012]本實用新型針對血樣等微量樣品中低濃度物質的快速、靈敏、便捷檢測需求，為解決現(xiàn)有檢測方法的不夠便捷和金標試條非定量化的局限性問題：I)目前檢測針對血液樣品中CRP及其更低濃度的蛋白類物質和細胞等時，需要多步操作，不適于快速的現(xiàn)場檢測、床邊檢測等；2)多步檢測反應，在每步操作中增加了誤差，微栗進樣控制差異會導致檢測結果的偏差，并增加了檢測的復雜性;3)金標試條的定量化檢測不足。因此，本實用新型結合微流控技術和免疫磁富集分離技術，結合F-TIR光學檢測，樣品富集區(qū)和檢測區(qū)提供了一種基于磁微粒子的具有通道的光學微流控芯片。
[0013](二)技術方案
[0014]為達到上述目的，本實用新型提供了一種基于磁微粒子的具有通道的光學微流控芯片，包括：下層基板和上層蓋板;形成于下層基板上表面、上層蓋板下表面或下層基板與上層蓋板之間的加樣槽、反應池、反應排氣孔、標定槽、標定池和標定排氣孔；以及形成于上層蓋板且分別與加樣槽、反應排氣孔、標定槽及標定排氣孔位置對應的開口；其中，該光學微流控芯片還包括:形成于下層基板上表面、上層蓋板下表面或下層基板與上層蓋板之間的反應通道、反應細通道、標定通道和標定細通道，其中，加樣槽通過反應通道連通于反應池，反應池通過反應細通道連通于反應排氣孔，標定槽通過標定通道連通于標定池，標定池通過標定細通道連通于標定排氣孔。
[0015]上述方案中，所述反應通道和所述標定通道，均采用親水設計，覆蓋一層透明親水膜層。<