一種抗alpha-烯醇化酶抗體免疫層析試紙條的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本實用新型涉及一種層析試紙條，屬于醫(yī)學(xué)免疫分析檢測領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 稀醇化酶(enolase)是1934年Lohman和Mayerhof在研究肌肉提取物中磷酸甘油酸 向丙酮酸轉(zhuǎn)換的過程中發(fā)現(xiàn)的。它既可催化糖酵解過程中2-磷酸-D-甘油酸(PGA)向磷酸-烯醇式丙酮酸(PEP)的轉(zhuǎn)化，又可在糖原合成過程中，催化逆向反應(yīng)，即作為磷酸丙酮酸水 合酶，使PEP向PGA轉(zhuǎn)化，因此烯醇化酶在細(xì)胞能量代謝過程中起重要的作用【J Biol Chem， 2〇〇〇,275(8):5958-5965】。在脊椎動物中，烯醇化酶存在3種同功酶 :€1，0，丫。€[-烯醇化酶在 許多組織均存在，β-烯醇化酶幾乎僅見于肌肉組織，γ-烯醇化酶則主要存在于神經(jīng)元和神 經(jīng)內(nèi)分泌組織。根據(jù)它們的分布和作用不同，Ct-烯醇化酶又稱為非神經(jīng)元烯醇化酶(11 011-neural enolase，NNE)、enolase I (eno-1)、磷酸稀醇丙酮酸脫氫酶（phosphopyruvate hydratase)、c_myc啟動子結(jié)合蛋白（c-myc promoter-binding protein，MBP_1 )、纖維蛋白 溶酉每原結(jié)合蛋白（plasminogen-binding protein) 0
[0003] NNE在結(jié)構(gòu)上高度保守，除了作為糖酵解反應(yīng)的限速酶，還作為自身抗原參與機體 免疫反應(yīng)。研究證明，多種自身免疫病均可檢出抗NNE抗體。NNE作為一種自身抗原，既是胞 漿酶，又可表達(dá)于腎臟、血管等組織及一些細(xì)胞如內(nèi)皮細(xì)胞膜或與細(xì)胞表面結(jié)合?？筃NE自 身抗體通過識別NNE的膜聯(lián)形式和/或干擾它的功能而于局部誘發(fā)免疫炎性反應(yīng)。自身免疫 性視網(wǎng)膜病變患者體內(nèi)存在抗NNE抗體，并特異定位于視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層及內(nèi)核層，誘導(dǎo) 該區(qū)域細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致失明【14此〇丨臟皿，2004,23(2):161-167】。存在于人呼吸道上皮細(xì)胞 中的NNE自身抗原誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)，造成呼吸道上皮細(xì)胞損傷，誘發(fā)氣道炎癥反應(yīng)，參 與重癥哮喘和阿斯匹林敏感性哮喘的發(fā)生【J Allergy Clin Immunol，2006，118(2) :376_ 381】。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑膜中可見大量的NNE表達(dá)，作為一種自身抗原，NNE發(fā)生 氨基甲酰鳥氨酸化，并刺激機體產(chǎn)生特異性自身抗體，從而引發(fā)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的慢性炎 癥反應(yīng)【Arthritis Res Ther，2005,7(6): 1421-1429】。研究還發(fā)現(xiàn)，大約有10-18%的炎癥 性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD)血清中抗 NNE 抗體陽性【Clin Exp Tmmunol·1998;112:10-16】。
[0004] 目前實驗室常用的檢測抗NNE的方法是酶聯(lián)免疫吸酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)和免疫跡法（immunoblotting test，IBT) 〇尚未發(fā) 現(xiàn)有商品化的抗NNE抗體檢測試劑盒。
[0005] ELISA法檢測可用于高通量標(biāo)本測定，靈敏度也較高，目前被廣泛認(rèn)可，但操作比 較繁瑣，需多次加樣和洗滌，完成整個實驗過程需三小時左右，且易受溫度和孵育條件的影 響，需酶標(biāo)儀，亦需要專業(yè)免疫學(xué)技術(shù)人員在專業(yè)實驗室中進(jìn)行實驗操作，給實驗帶來諸多 不便。
[0006] 免疫印跡法綜合了 SDS-PAGE的高分辨力和ELI SA法的高特異性和敏感性，但操作 相對復(fù)雜，完成整個實驗過程需三小時左右，亦需要專業(yè)免疫學(xué)技術(shù)人員在實驗室中進(jìn)行 實驗操作，同時易受各種溫度和孵育時間等環(huán)境條件因素的影響，對試驗帶來諸多不便。且 試劑具有較強的毒性和污染性。
[0007] 免疫層析法（immunochromatography)是近幾年來興起的一種快速診斷技術(shù)，其原 理是將特異的抗體先固定于硝酸纖維素膜的某一區(qū)帶，當(dāng)該干燥的硝酸纖維素一端浸入樣 品(尿液或血清)后，由于毛細(xì)管作用，樣品將沿著該膜向前移動，當(dāng)移動至固定有抗體的區(qū) 域時，樣品中相應(yīng)的抗原即與該抗體發(fā)生特異性結(jié)合，形成肉眼可見的檢測帶。現(xiàn)有的免疫 層析試紙條產(chǎn)品常用的示蹤標(biāo)記粒子有納米金、納米硒、乳膠等等，其中以納米金應(yīng)用最為 廣泛。
[0008] 與其他檢測方法相比，免疫層析法檢測時間短，只需要5~20分鐘，操作人員無需 培訓(xùn)，操作簡便、快速，無需低溫保存，儲運方便等優(yōu)勢。
[0009] 在自體免疫性疾病診斷方面，已出現(xiàn)較多的免疫層析試紙，但抗NNE抗體的免疫層 析試紙在國內(nèi)外市場上仍沒有問世。 【實用新型內(nèi)容】
[0010] 本實用新型所要解決的技術(shù)問題是為了克服現(xiàn)有方法的不足，將免疫層析法應(yīng)用 到抗NNE抗體的檢測中，采用間接免疫法來實現(xiàn)對樣品中的NNE抗體進(jìn)行檢測，通過把NNE抗 原蛋白包被在結(jié)合墊或分析膜檢測帶上，實現(xiàn)對樣品中NNE抗體的高特異、高準(zhǔn)確性的檢 測，快速篩查抗NNE抗體陽性標(biāo)本，為臨床炎癥性腸病等自體免疫性疾病提供快速的輔助診 斷。
[0011] 本實用新型所要解決的技術(shù)問題在于提供一種免疫層析法抗NNE抗體測試紙條。
[0012] 本實用新型所要解決的技術(shù)問題可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)：
[0013] -種抗NNE抗體免疫層析試紙條，包括樣品墊（1)、結(jié)合墊(2)、分析膜(3)、吸水墊 (6)、底板(7)、檢測帶T線(4)和質(zhì)控帶C線(5)，所述底板的上部貼合有分析膜，所述分析膜 上部的兩端分別貼合有結(jié)合墊和吸水墊，所述結(jié)合墊上部的一端貼合有樣品墊，所述檢測 帶T線和質(zhì)控帶C線設(shè)置在分析膜上。
[0014] 所述的結(jié)合墊(2)包被膠體金或彩色膠乳標(biāo)記物。
[0015] 優(yōu)選例1中，所述的結(jié)合墊⑵包被有標(biāo)記的NNE抗原蛋白，所述的檢測帶T線⑷包 被有抗人IgG，所述的質(zhì)控帶C線(5)包被有NNE的單克隆或多克隆抗體的一種或多種。
[0016] 所述的NNE單克隆或多克隆抗體是指用NNE抗原蛋白作為免疫原所獲得的鼠源、兔 源、馬源、豚鼠源、駱駝源的單克隆抗體或多克隆抗體。
[0017]優(yōu)選例2中，所述的結(jié)合墊（2)包被有標(biāo)記的NNE抗原蛋白和標(biāo)記物b層;所述的檢 測帶T線(4)包被有抗人IgG，所述的質(zhì)控帶C線(5)包被有蛋白C。
[0018] 優(yōu)選例3中，所述的結(jié)合墊（2)包被有標(biāo)記物a層和標(biāo)記物b層;所述的檢測帶T線 (4)包被有NNE抗原，所述的質(zhì)控帶C線(5)包被有蛋白C。
[0019] 所述標(biāo)記物a層的標(biāo)記蛋白為抗人IgG單克隆抗體、抗人IgG多克隆抗體、葡萄球菌 A蛋白（SPA)、鏈球菌G蛋白（Protein G)中的一種或多種。
[0020] 所述的抗人IgG多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源、駱駝源或豚鼠源中的一種； 所述的抗人IgG單克隆抗體為鼠源、駱駝源或兔源中的一種。
[0021] 所述的控制線上的蛋白C與標(biāo)記物b層中的標(biāo)記蛋白B同時或不同時為單克隆抗體 或多克隆抗體中的一種，并且標(biāo)記物b層中的標(biāo)記蛋白B和質(zhì)控線上的蛋白C可發(fā)生特異性 結(jié)合形成免疫復(fù)合物。所述的多克隆抗體為鼠源、馬源、羊源、兔源、駱駝源或豚鼠源中的一 種，所述的單克隆抗體為鼠源、駱駝源或兔源中的一種。
[0022] 本實用新型所用的包被在質(zhì)控帶C線上的蛋白包括但不限于:NNE的特異性單抗或 多抗、動物的免疫球蛋白或抗其抗體，但必須能與結(jié)合墊b層的標(biāo)記蛋白發(fā)生免疫結(jié)合反 應(yīng)，形成免疫復(fù)合物。比如結(jié)合墊b層的包被蛋白是標(biāo)記的NNE，質(zhì)控帶的包被蛋白是任何動 物來源的抗NNE抗體;如果結(jié)合墊b層的包被蛋白是鼠 IgG，質(zhì)控帶的包被蛋白是任何動物來 源的抗鼠 IgG的單抗或多抗。選用哪一對的結(jié)合墊b層蛋白和質(zhì)控帶C線蛋白不是本實用新 型的關(guān)鍵，實施例例舉幾組常用的結(jié)合墊b層標(biāo)記蛋白與質(zhì)控帶C線包被蛋白組合，其目的 不是限制該組合類型。
[0023] 所述的NNE抗原蛋白為通過原核/真核表達(dá)系統(tǒng)克隆化基因獲得，或通過氨基酸合 成重要抗原表位偶聯(lián)到載體蛋白上獲得。
[0024] 所述檢測是定性檢測樣本中的抗NNE抗體，對炎癥性腸病進(jìn)行輔助診斷。所述樣本 為血清、血衆(zhòng)、全血或其他體液。
[0025] 本實用新型所用的單克隆抗體用現(xiàn)有技術(shù)雜交瘤方法制備或者通過重組DNA法進(jìn) 行制備。
[0026] 本實用新型所用的多克隆抗體或通過免疫動物來制備。
[0027] 本實用新型所用的NNE抗原蛋白、SPA、Protein G用基因工程方法獲得。
[0028]本實用新型的檢測原理為（以結(jié)合墊上的標(biāo)記蛋白A為NNE蛋白，B為兔IgG為例）：
[0029] 膠體金或彩色膠乳標(biāo)記的蛋白A和蛋白B噴涂于結(jié)合墊，分析膜檢測帶T線上包被 抗人IgG，質(zhì)控帶C線上包被抗兔IgG。當(dāng)樣本隨著層析泳動到結(jié)合墊并浸潤膠體金或膠乳標(biāo) 記物時，其中的人I gG和標(biāo)記蛋白A結(jié)合形成人I gG-標(biāo)記蛋白A復(fù)合物，由于毛細(xì)管效應(yīng)，此 復(fù)合物沿向吸水墊方向泳動，如果樣品中含有抗NNE抗體，此復(fù)合物與包被于檢測帶T線上 的抗人IgG發(fā)生特異性免疫結(jié)合反應(yīng)，形成金標(biāo)/膠乳蛋白A(NNE)-人抗NNE IgG抗體-抗人 IgG三聯(lián)體復(fù)合物而被截留在檢測線上，逐漸富集形成較深的紫紅色條帶或膠乳顏色；由于 毛細(xì)效應(yīng)繼續(xù)泳動向前，金標(biāo)/膠乳兔IgG與包被在質(zhì)控線上的羊抗兔IgG發(fā)生特異的免疫 反應(yīng)被截留，逐漸富集在質(zhì)控線上形成較深的紫紅色條帶或膠乳顏色，多余的未結(jié)合的物 質(zhì)繼續(xù)層析到吸水墊上，因此在檢測線和質(zhì)控線都出現(xiàn)條帶的判為陽性結(jié)果;若血清樣品 中不含有抗NNE抗體，標(biāo)記蛋白A到達(dá)檢測線時，不與包被在檢測線上的NNE抗原蛋白發(fā)生免 疫反應(yīng)，