和載體框架連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞ToplO，挑單菌落至液體培養(yǎng)基LB培養(yǎng)，提質(zhì)粒 進(jìn)行電泳及酶切鑒定，獲得預(yù)期大小的片段5516bp和1040bp(如圖7)，經(jīng)酶切鑒定后陽(yáng)性克 隆者命名為pSV40En-VASA-SB100X(如圖8)，圖中列出部分酶切位點(diǎn)及相應(yīng)的元件名稱。該 轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒的序列如SEQ ID No . 3所示。序列中，SV40增強(qiáng)元件19-267 ; Vasa啟動(dòng)子 267-2461;SB100X CDS 2461-3479;Rabbit globin PolyA 3503-4037。
[0055] 實(shí)施例2
[0056] 實(shí)施例2是pSV40En-VASA-SB100X介導(dǎo)目的基因在雞胚的基因轉(zhuǎn)移測(cè)試結(jié)果，以及 與含有其他可表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)(如:含有巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(CMV))的轉(zhuǎn)座子系統(tǒng) 介導(dǎo)目的基因表達(dá)的比較。
[0057] 1、受精蛋的準(zhǔn)備
[0058]實(shí)驗(yàn)用種蛋（農(nóng)大三號(hào)）購(gòu)自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所。實(shí)驗(yàn)分為四組： pSV40En-VASA-SB100X組、pCMV-SB100X組、開(kāi)窗正常對(duì)照組及不開(kāi)窗對(duì)照組，每組重復(fù)3次， 實(shí)驗(yàn)組每次20枚蛋，對(duì)照組每次5枚蛋。
[0059] 2、質(zhì)粒的準(zhǔn)備
[0060] pSV40En-VASA-SB100X、pCMV-SB100X、pT3-PST-CAG-GFP 質(zhì)粒用無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒提取 試劑盒(QIAGEN公司）提取。其中，本實(shí)施例中轉(zhuǎn)座子載體pT3-PST-CAG-GFP的構(gòu)建方法，具 體方法參見(jiàn)參考文獻(xiàn)(沈丹，謝雨誘，李慶平等，多轉(zhuǎn)座子載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)座特性比較研究. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)，2015,48(11) :2270-2278)。該轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒(pT3-PST)包括PB、SB、To 12轉(zhuǎn) 座子兩側(cè)末端重復(fù)序列和Mscl克隆位點(diǎn)，克隆位點(diǎn)可插入需要轉(zhuǎn)移的目的基因表達(dá)盒。所 述目的基因盒可以是報(bào)告基因表達(dá)盒，或者其它外源基因表達(dá)盒。
[0061 ]將 pT3-PST-CAG-GFP 質(zhì)粒和 pSV40En-VASA-SB100X/pCMV-SB100X 轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒按1:2 比例混合均勻，終濃度調(diào)整為1 yg/yL，用pe I包裹后用于顯微注射。
[0062] 3、顯微注射雞胚
[0063] 實(shí)驗(yàn)分為四組:pSV40En-VASA-SB100X組、pCMV-SBIOOX組、開(kāi)窗正常對(duì)照組及不開(kāi) 窗對(duì)照組，每組重復(fù)3次，實(shí)驗(yàn)組每次20枚蛋，對(duì)照組每次5枚蛋。將3yL轉(zhuǎn)染液裝入玻璃毛細(xì) 管拉成的細(xì)針，通過(guò)調(diào)節(jié)氣體壓力，將轉(zhuǎn)染液注入14-16HH胚胎血管內(nèi)，于孵化的第14D取性 腺、心、肝、脾、肺、腎、腸、胃、腦等組織用體式熒光顯微鏡觀察胚胎各組織EGFP表達(dá)水平，記 錄陽(yáng)性胚胎數(shù)，同時(shí)統(tǒng)計(jì)孵化第7D和14D的成活率。
[0064] 4、不同啟動(dòng)子介導(dǎo)目的基因表達(dá)檢測(cè)
[0065] 在熒光顯微鏡下檢測(cè)熒光表達(dá)情況，結(jié)果顯示:實(shí)驗(yàn)組pSV40En-VASA-SB100X組和 pCMV-SBIOOX組在顯微注射后14D性腺表達(dá)綠色熒光蛋白（EGFP);并且vasa啟動(dòng)子介導(dǎo)的 EGFP只在性腺中表達(dá)，性腺陽(yáng)性率為11.03 %，而CMV啟動(dòng)子組則在腸、脾、大腦等組織均有 不同程度表達(dá)，性腺陽(yáng)性率1.67%，部分熒光照片如圖9所示。圖9中，性腺組織并排為一個(gè) 陽(yáng)性(P)，一個(gè)正常對(duì)照(N)，正常對(duì)照(N)在熒光場(chǎng)下不發(fā)光，因而看不清組織輪廓;對(duì)照組 (腸)也不發(fā)熒光，故在熒光場(chǎng)下看不出組織輪廓。從圖9中，可以看出相比于在腸和性腺都 具有熒光表達(dá)的pCMV-SB100X，pSV40En-VASA-SB100X具有性腺表達(dá)的特異性。此外，在相同 曝光參數(shù)等情況下，還可根據(jù)圖9的綠色熒光強(qiáng)度判斷出，pSV40En-VASA-SB100X組性腺表 達(dá)強(qiáng)度要高于PCMV-SB100X組。本實(shí)施例2的結(jié)論:通過(guò)顯微注射pSV40En-VASA-SB100X轉(zhuǎn)染 液至14-16HH胚胎血管內(nèi)進(jìn)行PGCs轉(zhuǎn)染，在vasa啟動(dòng)子和SV40增強(qiáng)子元件指導(dǎo)下，SB轉(zhuǎn)座酶 在PGCs中高效特異表達(dá)，從而介導(dǎo)含綠色熒光蛋白報(bào)告基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座，整 合進(jìn)入PGCs基因組，這些轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性PGCs迀移至生殖脊，生殖脊發(fā)育成性腺后，性腺能夠檢 測(cè)到綠色熒光報(bào)告基因的表達(dá)。提示本基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)能夠有效介導(dǎo)外源基因整合至PGCs基 因組，且具有PGCs轉(zhuǎn)染的特異性和高效性。
[0066]以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，本發(fā)明 要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)、說(shuō)明書(shū)及其等效物界定。
[0067]







【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，包括轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，所述 轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)包括轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒，其中，所述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒含有具有 如SEQ ID No.l所示核苷酸序列的vasa啟動(dòng)子。2. 如權(quán)利要求1所述的一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所 述轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒還含有通用增強(qiáng)子元件。3. 如權(quán)利要求2所述的一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所 述通用增強(qiáng)子元件為具有如SEQ ID No.2核苷酸序列所示的SV40增強(qiáng)子元件。4. 如權(quán)利要求1或者3所述的一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在 于，所述轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)為SB、PB、Tol2和/或ZB轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)。5. 如權(quán)利要求4所述的一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所 述轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒是PT3-PST，包括PB、SB、Tol2轉(zhuǎn)座子兩側(cè)末端重復(fù)序列和Mscl克隆位點(diǎn)， 克隆位點(diǎn)可插入需要轉(zhuǎn)移的目的基因表達(dá)盒。6. 如權(quán)利要求5所述的一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所 述目的基因盒是報(bào)告基因表達(dá)盒或者其它外源基因表達(dá)盒。7. 如權(quán)利要求6所述的一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在于，所 述轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒還包括SB100X轉(zhuǎn)座酶cDNA序列和Rabbit globin PolyA序列。8. 如權(quán)利要求1或者7所述的一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)，其特征在 于，在轉(zhuǎn)染所述特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)時(shí)，使用可調(diào)節(jié)氣體壓力的玻璃 毛細(xì)管細(xì)針進(jìn)行顯微注射。9. 一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方法，其特征在于，包括以下步驟： (1) 使用生物工程方法，構(gòu)建如權(quán)利要求1、2或者7所述的含有vasa啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)座酶輔 助質(zhì)粒的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)； (2) 使用生物工程方法，構(gòu)建含有需要轉(zhuǎn)移的目的基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒； (3) 提取質(zhì)粒后，將步驟(2)中所得的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒和步驟（1)中所得的轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒 按1:2比例混合均勻，調(diào)整其終濃度為500ng-1.5ygAiL; (4) 將步驟(3)中所得的混合質(zhì)粒使用包埋劑包裹后，轉(zhuǎn)染禽類早期胚胎血液中PGCs細(xì) 胞。10. 如權(quán)利要求9所述的一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移方法，其特征在于， 步驟(4)中所述的包埋劑為多聚乙烯亞胺(PEI)。
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種特異于禽類原始生殖細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和方法。該基因轉(zhuǎn)移系統(tǒng)包括含有具有如SEQ？ID？No.1所示核苷酸序列的vasa啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒。該基因轉(zhuǎn)移方法包括：(1)使用生物工程方法，構(gòu)建含有vasa啟動(dòng)子或者含有vasa啟動(dòng)子和通用增強(qiáng)子元件的轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒；(2)使用生物工程方法，構(gòu)建含有需要轉(zhuǎn)移的目的基因表達(dá)盒的轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒；(3)提取質(zhì)粒后，將上述轉(zhuǎn)座子供體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶質(zhì)粒按1:2比例混合均勻，調(diào)整其終濃度為500ng—1.5μg/μL；(4)將步驟(3)中所得的混合質(zhì)粒使用包埋劑包裹后，轉(zhuǎn)染禽類早期胚胎血液中PGCs細(xì)胞。通過(guò)本發(fā)明，可以實(shí)現(xiàn)外源基因在禽類胚胎PGCs基因組中高效特異整合，從而達(dá)到提高轉(zhuǎn)基因禽的制備效率的目的。
【IPC分類】C12N15/85
【公開(kāi)號(hào)】CN105524941
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201610035065
【發(fā)明人】高波, 王賽賽, 王亞麗, 沈丹, 薛松磊, 宋成義, 崔恒宓, 王克華, 黎壽豐
【申請(qǐng)人】揚(yáng)州大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年4月27日
【申請(qǐng)日】2016年1月19日