全視野載玻片多光譜成像系統(tǒng)和方法
【專利說明】
[0001] 相關(guān)申請交叉引用
[0002] 本申請要求享有于2013年1月10日提交的美國臨時專利申請第61/751，192號 的權(quán)益，通過引用將其全部內(nèi)容并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開涉及生物學(xué)樣本的成像的系統(tǒng)和方法，并且更具體地針對細(xì)胞和組織的全 視野載玻片（whole-slide)成像的系統(tǒng)和方法以及圖像分析。
【背景技術(shù)】
[0004] 已經(jīng)開發(fā)出能夠產(chǎn)生整個顯微鏡載玻片或其部分的數(shù)字圖像的全視野載玻片成 像系統(tǒng)。這些包括顯微鏡成像光學(xué)器件和數(shù)字相機以及清除樣本的掃描的機械設(shè)備以及協(xié) 調(diào)這些動作并且存儲得到的圖像的軟件。典型的病理樣品可以在大約10分鐘或更少的時 間內(nèi)成像，得到的圖像可以具有1/4微米或更精細(xì)的分辨率，對應(yīng)于15x15mm樣本的36億 像素。這些系統(tǒng)用在研究和臨床病理學(xué)的領(lǐng)域中以對組織切片、細(xì)胞學(xué)樣本以及對其進(jìn)行 顯微鏡成像是有價值的其他樣本進(jìn)行成像。
[0005] 這些工具中的一些基于響應(yīng)于激發(fā)光而來自樣本的熒光放射來產(chǎn)生圖像。熒光影 像對于通過諸如DAPI、Alexa熒光劑、Cy熒光劑這樣的熒光試劑以及在本領(lǐng)域中已知的其 他化合物制備的樣本是有用的。一些這樣的工具使用彩色數(shù)字相機以及包含多帶激發(fā)濾波 器（multiband excitation filter)和多帶放射濾波器（multiband emission filter)的 epi濾波器立方體（epi-filter cube)來生成樣本的3帶（3-band)圖像，其使得能夠在給 定的掃描中進(jìn)行達(dá)三種焚光劑的測量。Aperio ScanScope FL(可從Aperio, Vista，CA得 到)是這種類型的系統(tǒng)。
[0006] 其他的全視野載玻片掃描系統(tǒng)使用單色數(shù)字相機以及類似的印i濾波器立方體 和波長選擇性激發(fā)源來產(chǎn)生熒光圖像；它們在獲取第一圖像的同時以第一波長帶照明樣 本，然后在獲取第二圖像的同時以另外的帶對其照明，等等。由此，可以對三個、甚至四個 帶成像，通過可用于激發(fā)和放射過濾的光學(xué)濾波器來加以限制。3DHi Stech P250(可以從 3DHistech, Budapest, Hungary得到）是這種類型的掃描儀的示例。
[0007] 另外的熒光掃描儀使用單色數(shù)字相機并且利用一系列不同的印i濾波器立 方體，用每個濾波器立方體取得圖像。因為每個濾波器立方體可以具有其自己獨特 的激發(fā)和放射濾波器，所以不會限制到三個或四個帶。Leica SCMOOF(可從Leica Biosystems, Richmond, IL得到）是這種類型的系統(tǒng)的示例。
[0008] 存在能夠測量樣本的熒光圖像中的4個帶以上的多光譜成像系統(tǒng)。Vectra成 像系統(tǒng)（可從PerkinElmer, Waltham, MA得到）是這樣的系統(tǒng)的示例。其使用液晶可調(diào) 諧濾波器（liquid crystal tunable filter)，在計算機控制之下，在用單色數(shù)字相機取 得圖像的同時，選擇可見范圍內(nèi)的單個波長。這樣獲取的數(shù)據(jù)被稱為圖像立方體（image cube)，并且其包含圖像的多個空間位置的每處的光譜。能夠使用在樣本中存在的成分的 已知光譜的光譜庫，將每個點處的光譜去混合，成為其各個成分信號。Nuance軟件（可從 PerkinElmer，Waltham, MA得到）可以產(chǎn)生這樣的光譜庫，并且將它們用于將圖像立方體去 混合為成分圖像。
[0009] 生物學(xué)樣本一般響應(yīng)于激發(fā)光束而放射一些熒光，即使沒有施加外源熒光團也是 如此。這種所謂的自體熒光（autofluorescence)信號可能在組織樣本中是顯著的，并且可 能干擾對熒光探測信號的精確測量。如果用于去混合的光譜庫包括對應(yīng)于樣本自體熒光的 信號，則組織樣本中的自體熒光的效果可以減小或幾乎消除。如果包括這樣的信號，則在對 具有自體熒光的樣本的圖像立方體進(jìn)行去混合時，自體熒光信號可以是自體熒光成分圖像 的結(jié)果，并且對于與熒光染色和探測相關(guān)聯(lián)的成分圖像，獲得精確信號。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 一般地，在第一方面中，本公開提供方法，所述方法包括：獲得樣本的第一多個圖 像，其中第一多個圖像中的每個圖像對應(yīng)于入射到樣本上的照明光或來自樣本的放射光的 不同的光譜帶；獲得樣本的第二多個圖像，其中第二多個圖像中的每個圖像對應(yīng)于入射到 樣本上的照明光或來自樣本的放射光的不同的光譜帶；以及使用電子處理器來：基于來自 第一多個圖像中的第一圖像的信息和來自第二多個圖像中的第二圖像的信息來對齊第一 多個圖像和第二多個圖像，其中第一圖像和第二圖像對應(yīng)于共享光譜帶；以及組合第一多 個圖像的至少一些成員和第二多個圖像的至少一些成員以形成圖像棧。
[0011] 方法的實施例可以包括下面特征中的任何一個或多個。
[0012] 圖像棧中的每個像素可以包含從第一多個圖像的至少一個成員得出的光譜信息 以及從第二多個圖像的至少一個成員得出的光譜信息。對齊第一多個圖像和第二多個圖像 可以包含使用電子處理器對第一多個圖像和第二多個圖像進(jìn)行空間配準(zhǔn)，使得第一多個圖 像和第二多個圖像中的每個成員對應(yīng)于樣本的公共區(qū)域。圖像棧中的每個像素可以包含對 應(yīng)于入射到樣本上的照明光或來自樣本的放射光的至少5個不同的光譜帶的光譜信息。
[0013] 所述方法可以包括使用電子處理器對圖像棧去混合以獲得一個或多個成分圖像， 每個成分圖像包含實質(zhì)上僅來自樣本中的一個成分的貢獻(xiàn)。成分圖像中的一個可以對應(yīng)于 來自樣本的自體熒光。成分圖像中的至少一個可以對應(yīng)于自體熒光之外的樣本的成分。
[0014] 所述方法可以包含使用電子處理器基于一個或多個成分圖像來分析樣本以確定 樣本內(nèi)的特征的位置。
[0015] 第一多個圖像和第二多個圖像中的每個成員可以對應(yīng)于來自樣本的熒光放射。第 一多個圖像中的每個成員可以對應(yīng)于在用不同波長帶的光照明樣本之后的來自樣本的熒 光放射，并且其中第二多個圖像中的每個成員可以對應(yīng)于在用不同波長帶的光照明樣本之 后的來自樣本的熒光放射。所述方法可以包含使用彩色相機來獲得第一多個圖像和第二多 個圖像。
[0016] 所述方法的實施例還可以適當(dāng)?shù)匾匀魏谓M合的形式包含在本文中公開的任何其 他特征和/或步驟。
[0017] 在另一方面中，本公開提供系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包括被配置為用照明光照明樣本的照 明源、被配置為獲得樣本的一個或多個圖像的檢測器以及耦接到檢測器的電子處理器，并 且電子處理器被配置為：獲得樣本的第一多個圖像，其中第一多個圖像中的每個圖像對應(yīng) 于來自照明源的、入射到樣本上的照明光或來自樣本的放射光的不同的光譜帶；獲得樣本 的第二多個圖像，其中第二多個圖像中的每個圖像對應(yīng)于來自照明源的、入射到樣本上的 照明光或來自樣本的放射光的不同的光譜帶；基于來自第一多個圖像中的第一圖像的信息 和來自第二多個圖像中的第二圖像的信息來對齊第一多個圖像和第二多個圖像，其中第一 圖像和第二圖像對應(yīng)于共享光譜帶；以及組合第一多個圖像的至少一些成員和第二多個圖 像的至少一些成員以形成圖像棧。
[0018] 所述系統(tǒng)的實施例可以包括下面特征中的任何一個或多個。
[0019] 圖像棧中的每個像素可以包含從第一多個圖像的至少一個成員得出的光譜信息 以及從第二多個圖像的至少一個成員得出的光譜信息。電子處理器可以被配置為通過對第 一多個圖像和第二多個圖像進(jìn)行空間配準(zhǔn)，使得第一多個圖像和第二多個圖像中的每個成 員對應(yīng)于樣本的公共區(qū)域，來對齊第一多個圖像和第二多個圖像。圖像棧中的每個像素可 以包含對應(yīng)于入射到樣本上的照明光或來自樣本的放射光的至少5個不同的光譜帶的光 譜信息。
[0020] 電子處理器可以被配置為對圖像棧去混合以獲得一個或多個成分圖像，每個成分 圖像包含實質(zhì)上僅來自樣本中的一個成分的貢獻(xiàn)。成分圖像中的一個可以對應(yīng)于來自樣本 的自體焚光。成分圖像中的至少一個可以對應(yīng)于自體焚光之外的樣本的成分。
[0021] 電子處理器可以被配置為基于一個或多個成分圖像來分析樣本以確定樣本內(nèi)的 特征的位置。
[0022] 第一多個圖像和第二多個圖像中的每個成員可以對應(yīng)于來自樣本的熒光放射。第 一多個圖像中的每個成員可以對應(yīng)于在用不同波長帶的光照明樣本之后的來自樣本的熒 光放射，并且其中第二多個圖像中的每個成員可以對應(yīng)于在用不同波長帶的光照明樣本之 后的來自樣本的熒光放射。檢測器可以包含彩色相機，并且電子處理器可以被配置為使用 彩色相機來獲得第一多個圖像和第二多個圖像。
[0023] 所述系統(tǒng)的實施例還可以適當(dāng)?shù)匾匀魏谓M合的形式包含在本文中公開的任何其 他特征和/或方面和/或組件。
[0024] 除非以其他方式定義，在本文中所使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本公開所屬的技 術(shù)領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的具有相同含義。盡管與在本文中所公開的方法和材 料類似或等同的方法和材料可以用在本文的主題的實踐或測試中，在下面描述適合的方法 和材料。通過引用將所有公開、專利申請、專利以及在本文中提及的其他參考文獻(xiàn)的全部內(nèi) 容并入本文。在沖突的情況下，本說明書（包括定義）將進(jìn)行控制。另外，材料、方法和示 例僅是示例性的，而不用于進(jìn)行限制。
[0025] 下面將結(jié)合附圖和描述來闡述一個或多個實施例的細(xì)節(jié)。根據(jù)該描述、附圖和權(quán) 利要求，其他特征和優(yōu)點將是顯而易見的。
【附圖說明】
[0026] 圖1是示出對應(yīng)于一組印i濾波器的光譜帶的一組圖。
[0027] 圖2是示出對應(yīng)于另一組epi濾波器的光譜帶的一組圖，其中激發(fā)和分色濾波器 與在圖1的印i濾波器的組中的相同。
[0028] 圖3是示出RGB相機中的單個色彩通道的光譜響應(yīng)的圖。
[0029] 圖4是示出對應(yīng)于另一組印i濾波器的光譜帶的一組圖。
[0030] 圖5是示出形成樣本的多光譜圖像的一系列步驟的流程圖。
[0031] 圖6是示出形成樣本的多光譜圖像和使圖像去混合（unmix)的一系列步驟的流程 圖。
[0032] 圖7是示出獲取樣本的多光譜圖像并使其去混合以及對成分圖像執(zhí)行圖像分析 的一系列步驟的流程圖。
[0033] 圖8是獲取樣本的光譜圖像的系統(tǒng)的示意圖。
[0034] 在各個圖中的相同的標(biāo)號指示相同的元件。
【具體實施方式】
[0035] 現(xiàn)有的全視野載玻片掃描系統(tǒng)具有對所獲得的圖像的質(zhì)量和或載玻片掃描速度 強加約束的很多實際限制。例如，用于移動載玻片的機械裝置不具有完美的重復(fù)性。另外， 其通常對改變epi濾波器是耗時的?？傊@些限制對這樣的系統(tǒng)的功能強加約束。
[0036] 為了以多帶對樣本進(jìn)行成像，將每個樣本位置呈現(xiàn)給相機，其中每個使用不同的 epi濾波器。這一般通過兩個掃描方案之一來達(dá)成。第一方案是一次訪問樣本中的每個位 置，并且同時輪流地用每個印i濾波器取得圖像。然而，該方案通常非常慢，因為在總的掃 描期間印i濾波器改變很多次。另一方案是用指定的印i濾波器對