轉(zhuǎn)錄本確定方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基于下一代測序（NGS)的測序序列（read)提供轉(zhuǎn)錄本（例如mRNA) 豐度的信息。
【背景技術(shù)】
[0002] 下一代測序技術(shù)在對核酸樣品測序時產(chǎn)生了大量短的測序序列。下一代測序中的 一個必要步驟是文庫制備或簡稱為"文庫制備（librarypr印）"。這個過程以mRNA或cDNA 作為輸入，產(chǎn)生短的cDNA片段的文庫，每個短的cDNA片段對應(yīng)一段mRNA分子。然后通過 NGS測序儀對這些片段測序，通常不是全部測序，而是在它們的起點(diǎn)和/或末端處部分地測 序。這樣就產(chǎn)生了短的核苷酸序列，它們被稱為測序序列，并且最常見的是通過NGS測序儀 存儲為1組代表遺傳密碼的核堿基的四個ASCII字符（例如，A、C、G、T或0、1、2、3)的序 列。為了推斷出原始樣品中存在哪些mRNA分子，將這些測序序列定位到參考基因組上。
[0003] 下一代測序已經(jīng)被用于各種基因組定位程序（US2013/110410A1)或DNA鑒定 方法中，例如，通過利用定位的基因組將序列的測序序列與某個生物體變體關(guān)聯(lián)起來（W0 2009/085412A1)〇
[0004]W02009/091798A1記載了一種獲取生物體的轉(zhuǎn)錄組圖譜（profile)的方法，所述 方法包括：對一個或多個cDNA分子測序以獲得測序序列；將每個測序序列與參考序列比 對。然而，現(xiàn)有的方法所不知道的是，使用短序列的測序序列的轉(zhuǎn)錄組分析的基本的主要問 題是多個轉(zhuǎn)錄本變體例如序列偏差不同的同種型（例如，基因的品系差異、點(diǎn)突變或一種 蛋白的剪接變體）情況下的比對步驟。通常難以將短序列的測序序列與一種轉(zhuǎn)錄本變體正 確地比對。
[0005] 基于序列的測序序列來組裝轉(zhuǎn)錄本測序數(shù)據(jù)的最常用的方法為"Cufflinks"方法 (Trapnell等，2010)。Cufflinks構(gòu)建了一個過于簡約的轉(zhuǎn)錄本集合，這些轉(zhuǎn)錄本"解釋" 了RNA-Seq試驗中觀測到的測序序列。Cufflinks是這樣來進(jìn)行的，即將對比組裝問題簡 化為二分圖中最大匹配中的問題。實質(zhì)上，Cufflinks通過構(gòu)建關(guān)于測序序列比對的覆蓋 關(guān)系和為該關(guān)系在有向非循環(huán)圖（directedacyclicgraph)上尋找最小路徑覆蓋，實現(xiàn)了 Dil-worth定理的構(gòu)造性證明。采用這種統(tǒng)計方法，Cufflinks利用已知的參考注釋，或者 在對僅使用參考基因組的轉(zhuǎn)錄本從頭組裝之后能夠估計出樣品中存在的轉(zhuǎn)錄本同種型的 豐度。Cufflinks采用雙末端（paired-end)測序試驗的統(tǒng)計模型，在給定片段集合的條件 下得出了轉(zhuǎn)錄本集合的豐度的似然。該似然函數(shù)能夠被證明具有唯一的最大值，Cufflinks 采用數(shù)值最優(yōu)化算法找到了該值。然后，程序放大這些概率以在給定轉(zhuǎn)錄本的擬用豐度的 條件下計算在試驗中會觀測到片段的總似然。由于Cufflinks的統(tǒng)計模型是線性的，因此 似然函數(shù)具有唯一的最大值，Cufflinks采用數(shù)值最優(yōu)化算法找到了該值。
[0006] Roberts等（2011)涉及通過校正片段偏差來提高RNA-Seq表達(dá)估計值的方法。 Wen-Ping等（2007)記載了混合建模自然種群中轉(zhuǎn)錄本豐度類別。
[0007] 現(xiàn)有的方法未能正確地區(qū)分轉(zhuǎn)錄本變體，并且未能獲得與其他轉(zhuǎn)錄本有關(guān)的正確 的轉(zhuǎn)錄本數(shù)量或豐度。如本文中通過比較所示，甚至Cufflinks方法在幾次試驗中也未能 得出正確的轉(zhuǎn)錄本豐度信息。
[0008] 本發(fā)明的目的是提供使轉(zhuǎn)錄本豐度的評價更加準(zhǔn)確的改進(jìn)方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種估計轉(zhuǎn)錄本豐度的方法，所述方法包括以下步驟：
[0010] a)從所關(guān)心的遺傳基因座中的轉(zhuǎn)錄本的潛在混合物中獲取轉(zhuǎn)錄本片段測序數(shù) 據(jù)；
[0011] b)將所述片段測序數(shù)據(jù)分配給所關(guān)心的所述基因座的遺傳基因坐標(biāo)，從而獲得片 段遺傳基因坐標(biāo)覆蓋的數(shù)據(jù)集，各遺傳基因坐標(biāo)的所述覆蓋相結(jié)合形成覆蓋包絡(luò)曲線（也 稱為總覆蓋直方圖或總直方圖（histogramoftotal));
[0012] c)設(shè)置所述混合物的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量；
[0013]d)為每個轉(zhuǎn)錄本i預(yù)先設(shè)置建模的基因覆蓋的概率分布函數(shù)，i代表轉(zhuǎn)錄本的數(shù) 值標(biāo)識，其中所述概率分布函數(shù)由所述轉(zhuǎn)錄本i的權(quán)重因子ai與至少2個概率子函數(shù)j之 和的數(shù)學(xué)乘積構(gòu)成，j代表概率子函數(shù)的數(shù)值標(biāo)識，每個概率子函數(shù)j用權(quán)重因子βu獨(dú)立 地加權(quán)；
[0014]e)將每個轉(zhuǎn)錄本的概率分布函數(shù)相加，獲得和函數(shù)；
[0015]f)使所述和函數(shù)擬合到所述覆蓋包絡(luò)曲線，從而優(yōu)化α占βU的值以提高擬 合；
[0016]g)重復(fù)步驟e)和f)，直到預(yù)先設(shè)置的收斂判據(jù)已經(jīng)得到滿足，從而獲得所述混合 物的每個轉(zhuǎn)錄本的估計轉(zhuǎn)錄本豐度，所述的估計轉(zhuǎn)錄本豐度用在收斂判據(jù)已經(jīng)得到滿足之 后經(jīng)優(yōu)化的權(quán)重因子ai表示。
[0017] 本發(fā)明還提供一種利用該方法的計算機(jī)程序產(chǎn)品，例如包含用于在計算機(jī)上執(zhí)行 或協(xié)助所述方法和步驟的機(jī)器代碼的計算機(jī)程序產(chǎn)品。計算機(jī)程序產(chǎn)品可設(shè)置在任何種類 的存儲設(shè)備上。還提供了一種系統(tǒng)（例如計算機(jī)設(shè)備），其被編程以協(xié)助執(zhí)行本發(fā)明的方法 的步驟。計算步驟通常無需操作者的幫助即可進(jìn)行。輸入與設(shè)置步驟可通過程序或系統(tǒng)來 協(xié)助進(jìn)行，例如通過提示步驟d)中概率子函數(shù)的數(shù)量與類型的選項建議。當(dāng)然，該程序或 系統(tǒng)也可用默認(rèn)參數(shù)來執(zhí)行，而無需來自操作者的進(jìn)一步輸入。
[0018] 除了被明確指出的之外，如下的詳細(xì)說明和優(yōu)選的實施方式適用于本發(fā)明的各個 方面，并且能夠不受限制地相互結(jié)合。優(yōu)選的各實施方式和方面在權(quán)利要求書中進(jìn)行了定 義。
【具體實施方式】
[0019] 本發(fā)明使用數(shù)值方法從轉(zhuǎn)錄本片段序列的樣品獲得轉(zhuǎn)錄本豐度信息。
[0020] 該方法（NGS)將測序序列（通常稱為轉(zhuǎn)錄本片段序列）與參考序列（例如參考基 因組）比對，從而獲得遺傳覆蓋信息（步驟b)。用于此目的的現(xiàn)有的統(tǒng)計工具常常對觀測 到的數(shù)據(jù)的性質(zhì)進(jìn)行不切實際的假定，因此對轉(zhuǎn)錄本濃度的估計不準(zhǔn)確。某些最廣泛使用 的工具（例如Cufflinks)假定沿轉(zhuǎn)錄本的測序序列的分布不均勻，這與目前的mRNA-Seq 方案（mRNA-Seqprotocol)相矛盾。本發(fā)明提供一種統(tǒng)計模型，該統(tǒng)計模型能夠同時得知 沿轉(zhuǎn)錄本的測序序列分布的偏差以及轉(zhuǎn)錄本豐度。為此，通過與擬合步驟中的轉(zhuǎn)錄本豐度 一起訓(xùn)練的混合函數(shù)建模轉(zhuǎn)錄本的測序序列或片段分布。擬合步驟中所使用的方法可以從 現(xiàn)有的最大化或最小化程序（例如使用期望最大化算法的最大似然框架）中推導(dǎo)出來。由 于本發(fā)明的模型中的測序序列的總概率分布是混合的混合，因此將這種模型稱為Mix2 (讀 作混合的平方）模型。下文表明Mix2模型是非常通用的，并且通過可選參數(shù)綁定可以被調(diào) 整為數(shù)據(jù)所固有的不同結(jié)構(gòu)。特別地，用于獲得轉(zhuǎn)錄本豐度的方法可適用于與轉(zhuǎn)錄本相關(guān) 的概率分布。試驗表明Mix2模型實現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄本豐度的估計明顯好于Cufflinks程序中所使 用的統(tǒng)計模型。即使從不準(zhǔn)確的轉(zhuǎn)錄本注釋開始，Mix2模型也能夠從數(shù)據(jù)中得知正確的注 釋，并產(chǎn)生遠(yuǎn)遠(yuǎn)優(yōu)于現(xiàn)有技術(shù)的豐度估計。由于在擬合步驟過程中優(yōu)秀的學(xué)習(xí)能力，因此初 始參數(shù)（例如在分配步驟a)過程中或者在步驟d)中選擇（例如隨機(jī)的）概率分布函數(shù)的 過程中所選擇的初始參數(shù)）不是至關(guān)重要的。甚至所假定的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量也可以不同。有 可能錯誤的轉(zhuǎn)錄本注釋或轉(zhuǎn)錄本數(shù)量假定會通過例如使1個或多個轉(zhuǎn)錄本的概率分布函 數(shù)擬合到豐度為〇來校正。能夠被建模為概率的權(quán)重因子α將表示收斂后的轉(zhuǎn)錄本的豐 度。
[0021] 本文中使用的"所關(guān)心的遺傳基因座"并不將所述方法局限于染色體上基因的1 個連續(xù)的序列延伸。它通常是指遺傳基因序列的1個或多個段。可將遺傳基因座與基因組 坐標(biāo)關(guān)聯(lián)起來，提供序列的測序序列（轉(zhuǎn)錄本片段序列）的位置信息。本文中使用遺傳基 因"位置"或"坐標(biāo)"來表示參考序列上從數(shù)值上識別的與參考序列的起點(diǎn)有一定距離的核 苷酸。如果遺傳基因坐標(biāo)與轉(zhuǎn)錄本相容，也就是該遺傳基因坐標(biāo)位于轉(zhuǎn)錄本外顯子中的任 何一個中的情況，該遺傳基因坐標(biāo)可以用基因組坐標(biāo)或轉(zhuǎn)錄本坐標(biāo)表示。通過計算與轉(zhuǎn)錄 本起點(diǎn)的相對距離并減去基因組坐標(biāo)前面的內(nèi)含子的長度，將相容的基因組坐標(biāo)變換成轉(zhuǎn) 錄本坐標(biāo)。通過使該過程顛倒過來，可以將轉(zhuǎn)錄本坐標(biāo)變換成基因組坐標(biāo)。通過收縮、拉伸 和移動概率子函數(shù)，可以把在一個轉(zhuǎn)錄本的坐標(biāo)上定義的概率分布轉(zhuǎn)化為另一個轉(zhuǎn)錄本的 轉(zhuǎn)錄本坐標(biāo)上的概率分布。
[0022] 核堿基類型（例如A、T/U、G、C)可能與基因組的坐標(biāo)或位置有關(guān)，也可能無關(guān)。通 常，一種類型的核堿基與每個轉(zhuǎn)錄本的每個遺傳基因坐標(biāo)有關(guān)。然而，對于每個遺傳基因坐 標(biāo)，不同的重疊轉(zhuǎn)錄本可能在核堿基構(gòu)成上不同，因為本發(fā)明可用于區(qū)分點(diǎn)突變，即不同的 轉(zhuǎn)錄本之間1個或多個核堿基可能有差別，尤其是在樣品含有不同生物體或不同等位基因 的核酸分子時。即使在轉(zhuǎn)錄本、其片段和所關(guān)心的基因座之間可能錯配的情況下，也可分配 共同的遺傳基因坐標(biāo)。步驟b)(將片段序列分配給遺傳基因坐標(biāo)）可以包括這些序列之間 的序列比較或比對，從而提供遺傳基因坐標(biāo)。序列比較是本領(lǐng)域中公知的（例如，通過提到 的開源cufflinks方法），包括核苷酸的比較。本發(fā)明的方法可以用在具有在給定的所關(guān) 心的遺傳基因座上的偏差序列的不同品系或生物體的數(shù)據(jù)上，也可用于區(qū)分不同的剪接變 體，即可以通過外顯子序列的不同組合來區(qū)分開不同的轉(zhuǎn)錄本。因此，分配步驟a)過程中 的錯配可能被允許或被禁止。這樣的錯配優(yōu)選每100個堿基最多有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10 或11個錯配。
[0023] 本發(fā)明可以建模轉(zhuǎn)錄本的混合物中的各個轉(zhuǎn)錄本的豐度（例如，作為相對量，與 概率對應(yīng)）。轉(zhuǎn)錄本片段測序數(shù)據(jù)可包括至少2個轉(zhuǎn)錄本序列，優(yōu)選包括3個、4個、5個、6 個、7個、8個、9個、10個、或者至少或至多15個、至少或至多20個、至少25個、至少或至多 30個、至少或至多40個轉(zhuǎn)錄本序列。轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量可以選擇，例如在對核酸樣品進(jìn)行的選 擇步驟中通過例如擴(kuò)增或去除核酸來選擇。如此去除或擴(kuò)增的核酸可以包含共同的序列延 伸，如與寡核苷酸探針對應(yīng)的序列、錨定序列或者選擇的引物序列。以這種方式可以選擇1 個或多個基因組基因座。在本發(fā)明的具體優(yōu)選的實施方式中，研究了 1個基因的轉(zhuǎn)錄本變 體。然而，一般來說，本文中使用的"轉(zhuǎn)錄本"可以指任何核酸或者任何基因或基因組合的 核酸序列及其任何變體，特別是其mRNA或cDNA序列變體。
[0024] 優(yōu)選所述轉(zhuǎn)錄本片段測序數(shù)據(jù)的轉(zhuǎn)錄本片段序列的長度為5~800個核苷酸，優(yōu) 選為6~600個核苷酸、7~400個核苷酸、8~200個核苷酸或9~150個核苷酸，甚至更 優(yōu)選為10~100個核苷酸、特別優(yōu)選為12~70個核苷酸。
[0025] 轉(zhuǎn)錄本片段序列的數(shù)量可以為至少或至多100個、至少或至多500個、至少或至多 1000個、至少或至多5000個、至少或至多10000個。對于每個轉(zhuǎn)錄本而言，轉(zhuǎn)錄本片段序列 的數(shù)量優(yōu)選為至少或至多10個，或者至少或至多20個、至少或至多50個。組合或者作為 替代物的轉(zhuǎn)錄本片段序列的數(shù)量可以為至多400000個、至多300000個、至多200000個、至 多100000個，或者至多50000個。
[0026] 至少1個或多個（例如全部）轉(zhuǎn)錄本的轉(zhuǎn)錄本長度可以為例如100~1000000個 核苷酸，優(yōu)選為1000~100000個核苷酸或者2000~10000個核苷酸。
[0027] 在優(yōu)選的實施方式中，所關(guān)心的遺傳基因座包括1個或多個基因或遺傳因子的1 個或多個同種型（例如，編碼轉(zhuǎn)錄本序列），優(yōu)選包括1個基因或遺傳因子的至少2個、3 個、4個或更多個剪接變體。所關(guān)心的遺傳基因座可以包括另一個基因或遺傳因子的1個或 多個其它的剪接變體。除了所述剪接變體之外或者作為所述剪接變體的替代物，所關(guān)心的 遺傳基因座還可以包括不同的等位基因。在優(yōu)選的實施方式中，所述基因或遺傳因子不僅 編碼蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄本（例如mRNA)，還編碼非編碼蛋白的轉(zhuǎn)錄本（例如，調(diào)控RNA或催化性 RNA，包括微RNA、snoRNA或rRNA)以及它們的前體，特別是微RNA前體或rRNA前體。
[0028] 本文中使用的"基因"和"遺傳因子"涉及具有被轉(zhuǎn)錄形成1個或多個轉(zhuǎn)錄本的序 列的遺傳核苷酸。
[0029] 本文中使用的"同種型"用來涉及轉(zhuǎn)錄本的具體的變體。1個"基因"或"遺傳因 子"的多個轉(zhuǎn)錄本可能不同，例如在多個剪接變體的情況下，因此產(chǎn)生不同的同種型。其它 的同種型變異可以是由例如不同微生物或者品系的混合物中轉(zhuǎn)錄本物質(zhì)的不同等位基因 或不同來源造成。
[0030] 設(shè)置轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量的步驟可包括：從所關(guān)心的遺傳基因座獲取預(yù)先注釋的序列數(shù) 據(jù)，以及將轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量設(shè)置為至少是從所關(guān)心的遺傳基因座預(yù)測的不同轉(zhuǎn)錄本序列（包 括視為不同轉(zhuǎn)錄本序列的剪接變體）的數(shù)量。如前所述，所設(shè)置的轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量可以超過 轉(zhuǎn)錄本的實際數(shù)量（該實際數(shù)量可能確切已知，也可能確切未知），因為在和函數(shù)的擬合過 程中可以除去不正確的轉(zhuǎn)錄本，結(jié)果產(chǎn)生收斂至0的1個或多個權(quán)重因子α。通常，所關(guān)心 的遺傳基因座是已知的，例如來自核酸選擇步驟中任意一步的cDNA生成步驟。使用注釋的 遺傳數(shù)據(jù)，能夠得出轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量的初始編號1_。對于每個轉(zhuǎn)錄本，將通過在步驟d)中設(shè) 置概率分布函數(shù)來建模豐度。這個函數(shù)包含權(quán)重因子α，其對應(yīng)于所述和與概率分布擬合 的收斂（迭代過程）后的所述混合物中轉(zhuǎn)錄本的豐度。該轉(zhuǎn)錄本的混合物為本發(fā)明的模型 的第一混合物。在擬合過程中，每個α可單獨(dú)被修正。因此，設(shè)置轉(zhuǎn)錄本的數(shù)量可能是粗 略的估計。例如，該數(shù)量可以為2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15，或者為16、20、30、 40或以上中的至少任意一個。
[0031] 每個概率分布函數(shù)在數(shù)學(xué)上包含第二混合物。該概率分布函數(shù)由2個或更多個 (例如，2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個）概率子函數(shù)或者"塊 (block)"構(gòu)成。為了能夠建模轉(zhuǎn)錄本的整個長度（轉(zhuǎn)錄本坐標(biāo)范圍）上的不對稱測序序列 分布，具有至少2個概率子函數(shù)是至關(guān)重要的。每個轉(zhuǎn)錄本的概率子函數(shù)的總數(shù)量為j_。 」_通常為約4~8。概率子函數(shù)的數(shù)量太高可能導(dǎo)致過度訓(xùn)練，降低計算效率。
[0032] 概率分布函數(shù)為概率子函數(shù)的和。值得注意的是，因子α加權(quán)整個概率分布函 數(shù)，因此同樣地加權(quán)下面的每個概率子函數(shù)。在概率分布函數(shù)中，概率子函數(shù)用權(quán)重因子 βυ分別加權(quán)。值得注意的是，對于每個轉(zhuǎn)錄本（即每個概率分布函數(shù)），這些β可能是無 關(guān)的或相關(guān)的因子（"綁定"）。在無關(guān)的情況下，每個β在擬合步驟中可單獨(dú)被修正。也 可以將不同的概率分布函數(shù)之間的β綁定起來，例如第一β，或者通常任何給定的1^對 于每個概率分布函數(shù)均是相同的（例如β2j)。這樣就將建模的權(quán)重因子β的數(shù)量 減少到僅為j_，而不是i_Xj_，從而簡化了擬合過程，減少了計算資源的使用。這種簡化 在可以預(yù)期每個轉(zhuǎn)錄本的類似的片段覆蓋分布時效果最好，例如，在給定的序列部分中預(yù) 期的豐度總是比其他部分中預(yù)期的豐度大一對于2個或多個（例如全部）轉(zhuǎn)錄本（"綁定 的"轉(zhuǎn)錄本）。這種假定通常對于大約相同或類似長度的轉(zhuǎn)錄本是成立的，例如長度（以核 堿基計）為另一個綁定的轉(zhuǎn)錄本的〇. 3~3. 2,優(yōu)選為0. 5~2. 1的轉(zhuǎn)錄本。當(dāng)然，在下文 中將會更清楚的是，概率子函數(shù)的其它參數(shù)也可以在不同轉(zhuǎn)錄本之間以相似的方式綁定， 還可以在給定的轉(zhuǎn)錄本的概率子函數(shù)之間以相似的方式綁定（例如，在遺傳基因坐標(biāo)方向 上橫向移動轉(zhuǎn)錄本的整個概率分布函數(shù)時）。而且，在步驟d)中，可以使轉(zhuǎn)錄本的概率子函 數(shù)歸一化為彼此大約相同的最大高度值或最大值（通常建模為概率或部分對概率分布函 數(shù)的總體有貢獻(xiàn)的概率）。
[0033] 根據(jù)對于參數(shù)綁定的另外的選擇，也可以只綁定1組轉(zhuǎn)錄本（即各個概率分布函 數(shù)）中的1個或多個參數(shù)（例如1個或多個β)-但沒有遍及所有的轉(zhuǎn)錄本（即每個概率 分布函數(shù)）。這樣的組可以通過概率分布函數(shù)的和函數(shù)的預(yù)期的類似形狀來定義。例如，組 可以通過類似的長度和/或類似的GC含量來定義。類似的長度為例如該組的所有成員的 長度均在所有成員的平均大小的+/-50%，優(yōu)選為+/_35%，更優(yōu)選為+/-30%的范圍內(nèi)的 情況。類似的GC含量例如可以在所有成員的平均GC含量的+/-10 %，優(yōu)選為+/-5%的范 圍內(nèi)。
[0034]本文中使用的"約"可以是指與給定的值相同的值，或者是指與給定的值相差 +/-10% 的值。
[0035] 轉(zhuǎn)錄本i的概率子函數(shù)的和與給定的權(quán)重因子構(gòu)成該轉(zhuǎn)錄本I的概率分布函數(shù)。 任何數(shù)學(xué)函數(shù)都可以選作概率子函數(shù)，條件是這些概率子函數(shù)的和能夠形成概率函數(shù)。由 于概率子函數(shù)構(gòu)成了能夠被擬合及優(yōu)化的計算模型的基礎(chǔ)，因此優(yōu)選參數(shù)不多的簡單函 數(shù)。概率子函數(shù)可以例如包括1個、2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個或10個確定 與遺傳基因坐標(biāo)有關(guān)的函數(shù)的形狀的函數(shù)參數(shù)，或者由這些函數(shù)參數(shù)組成。概率子函數(shù)j 優(yōu)選由每個遺傳基因坐標(biāo)的正值構(gòu)成。優(yōu)選概率子函數(shù)為非周期性函數(shù)和/或特別優(yōu)選該 概率子函數(shù)為密度函數(shù)或概率函數(shù)，但