本發(fā)明屬于材料科學(xué)和生命科學(xué)的交叉領(lǐng)域,涉及一種將納米氮化鐵復(fù)合材料用于DNA提取的方法。
背景技術(shù):
DNA提取是生物技術(shù)、基礎(chǔ)和臨床醫(yī)學(xué)、法醫(yī)學(xué)以及農(nóng)林學(xué)領(lǐng)域的常用實(shí)驗(yàn)技術(shù)。目前,提取DNA的傳統(tǒng)方法,包括苯酚氯仿抽提法和離心柱法,它們的操作復(fù)雜,用時(shí)長(zhǎng),使用苯酚氯仿抽提時(shí)用還到了苯酚、氯仿等毒性試劑,且它們均不利于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化、高通量操作。為了克服這些問題,出現(xiàn)了磁分離方法。磁分離方法是利用磁性微球,在微球的表面修飾上對(duì)核酸有吸附作用的特定活性官能基團(tuán),利用磁珠的磁性,在外磁場(chǎng)的作用下對(duì)DNA進(jìn)行分離、富集的技術(shù)。隨著納米材料科學(xué)的發(fā)展,磁性微球已經(jīng)開始被用于核酸的分離純化,具有高效、快速、無污染、易于操作等優(yōu)勢(shì),展現(xiàn)了廣闊的發(fā)展前景。
目前已經(jīng)用于DNA提取的納米磁性材料為鐵的氧化物,且氧化鐵材料用于DNA分離純化方面的技術(shù)已經(jīng)趨于成熟。它已經(jīng)有了比較合適的表面修飾方法以及與DNA大分子偶聯(lián)的方法。市場(chǎng)上已經(jīng)有了以Fe3O4作為磁性材料的試劑盒。
目前公開的專利和文獻(xiàn)中,報(bào)道的磁分離法提取DNA所用的磁珠均為鐵及鐵的氧化物。尚未見將納米氮化鐵用于DNA的提取的報(bào)道。而氮化鐵的磁性比傳統(tǒng)的氧化鐵要強(qiáng),將其用于DNA的提取,與傳統(tǒng)磁珠相比,有磁響應(yīng)性好,分離靈敏、速度快等優(yōu)勢(shì),而且分離同樣的DNA,磁珠的用量會(huì)更少,更利于相關(guān)自動(dòng)化、高通量?jī)x器的研發(fā)。
石墨烯(Graphene)是一種由碳原子以sp2雜化軌道組成六角型呈蜂巢晶格的平面薄膜,只有一個(gè)碳原子厚度的二維碳材料。石墨烯具有強(qiáng)的韌性、電導(dǎo)性及導(dǎo)熱性。鐵及鐵氮化合物具有優(yōu)良的磁性能,但其化學(xué)穩(wěn)定性較差,尤其是鐵相。利用石墨烯作為包覆材料能夠很好改善磁性顆粒的化學(xué)穩(wěn)定性及電導(dǎo)性差的問題,使得這種復(fù)合材料能夠很好地應(yīng)用在磁流體、靶向藥物、電磁波吸收材料、電磁屏蔽材料、氧化還原催化劑、精細(xì)陶瓷材料和鋰電池等多個(gè)領(lǐng)域。
目前公開的專利和文獻(xiàn)中,報(bào)道的多是碳包覆金屬納米顆粒的制備方法,如熱解法、電弧法、浸漬法、CVD法等獲得碳包覆鐵納米顆粒;對(duì)于石墨烯包覆的鐵氮化合物納米顆粒,并沒有一種方法可以直接獲得。
申請(qǐng)公布號(hào)為CN101347455A,公布日為2009年1月21日,專利名為一種碳包覆鐵納米粒子及其作為治療肝癌藥物載體的應(yīng)用,其發(fā)明了一種碳包覆鐵納米粒子,特別是由直流電弧法制備獲得。
申請(qǐng)公布號(hào)為CN102623696A,公布日為2012年8月1日,專利名稱:一種殼核型包覆氮化鐵納米復(fù)合粒子制備方法與應(yīng)用,其發(fā)明了一種殼核型碳包覆氮化鐵納米復(fù)合粒子制備工藝,特別是以直流等離子體原位合成的碳包覆鐵納米顆粒作為前驅(qū)體,再經(jīng)過氮化工藝獲得碳包覆氮化鐵納米復(fù)合粒子。
申請(qǐng)公布號(hào)為CN101710512A,公布日為2010年5月19日,專利名為石墨烯與碳包覆鐵磁性納米金屬復(fù)合材料及其制備方法。其發(fā)明了一種由石墨烯及碳包覆的鐵磁性納米顆粒,且提供了一種特殊的CVD法制備出該種復(fù)合粉體材料。
這些方法都具有各自的優(yōu)點(diǎn),但是也有較多的不足,如試驗(yàn)設(shè)備復(fù)雜、制備條件嚴(yán)格、流程繁瑣等,造成制備成本較高,從而影響石墨烯/碳包覆鐵和鐵氮化合物粉體的開發(fā)與應(yīng)用。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:
鑒于上述本領(lǐng)域的現(xiàn)狀,本發(fā)明目的在于提供一種將納米氮化鐵復(fù)合材料用于DNA提取的方法,通過對(duì)納米氮化鐵復(fù)合材料進(jìn)行表面修飾,從而使其能與DNA大分子偶聯(lián),將其應(yīng)用于DNA的提取。
本發(fā)明首先提供一種石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性復(fù)合材料。
本發(fā)明還提供一種石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性復(fù)合材料的制備方法,且該方法可以通過調(diào)控制備過程中等離子體的含氮比來調(diào)控磁性核的物相類型。
本發(fā)明技術(shù)方案如下:
一種石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性復(fù)合材料,具有核殼結(jié)構(gòu),殼體為石墨烯殼,由多層石墨烯片組成,殼層厚度為5-50nm;核芯為磁性核,是顆粒直徑為10-90nm相態(tài)可變的納米磁性顆粒。
其中,所述納米磁性顆粒的相態(tài)為鐵相的α-Fe、γ-Fe,和γ-Fe(N)、γ’-Fe4N、ε-Fe3N、α”-Fe16N2相的鐵氮化合物中的一種或多種。
本發(fā)明還提出所述的石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性復(fù)合材料的制備方法,包括以下步驟:
(1)連續(xù)并多次對(duì)等離子體產(chǎn)生裝置的反應(yīng)腔體進(jìn)行惰性氣體清洗后,以惰性氣體充滿整個(gè)反應(yīng)腔體,隔絕空氣;
(2)通過等離子體電源激發(fā)得到穩(wěn)定的惰性氣體等離子體流后,通過輸入反應(yīng)氣源形成混合等離子體流,再將二茂鐵粉末熱蒸發(fā),以載流氣形式將二茂鐵蒸氣送入等離子體中心區(qū)域;
(3)利用等離子體高焓值及化學(xué)活化效果,將二茂鐵迅速熱解并發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后,在等離子體焰流尾部通過形核長(zhǎng)大得到納米磁性顆粒并且在顆粒表面包覆石墨烯;
(4)在惰性氣體保護(hù)條件下將反應(yīng)腔降到室溫,收集得到的復(fù)合粉體,即為石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料。
等離子體法制備石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性顆粒,與其他方法相比,制備顆粒度較小、粒徑分布均勻且可通過控制等離子體中的含氮比來獲得不同物相的磁性核。本發(fā)明采用二茂鐵(C10H10Fe)為反應(yīng)原料,通過等離子體促進(jìn)反應(yīng),直接獲得石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性顆粒復(fù)合粉體。
其中,采用二茂鐵(C10H10Fe)作為鐵源及碳源,二茂鐵粉末的蒸發(fā)流床溫度設(shè)置為100~400℃;所述載流氣為氬氣、氮?dú)?、氨氣的一種或多種。
進(jìn)一步地,所述的等離子體流是感性耦合等離子體流、容性耦合等離子體流及微波耦合等離子體流中的一種,均由惰性氣體和反應(yīng)氣源混合形成,反應(yīng)氣源和惰性氣體的摩爾比例為0~5:1;所述的惰性氣體為氬氣、氦氣、氖氣中的一種或多種,反應(yīng)氣源為氫氣、氮?dú)?、氨氣中的一種或多種。
其中,通過調(diào)整反應(yīng)氣源、惰性氣體和載流氣的流量來控制等離子體的含氮比,從而控制納米磁性顆粒的相態(tài)組成,使得納米磁性顆粒的相態(tài)為α-Fe、γ-Fe、γ-Fe(N)、γ’-Fe4N、ε-Fe3N、α”-Fe16N2中的一種或多種。
本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案之一為:所述等離子體的含氮比(氮原子占等離子體總原子量的摩爾比)為0時(shí),所得復(fù)合材料中的納米磁性顆粒的相態(tài)為鐵相的α-Fe和γ-Fe中的一種或兩種。
本發(fā)明的另一優(yōu)選技術(shù)方案為:所述等離子體的含氮比為5~80%時(shí),所得復(fù)合材料中的納米磁性顆粒的相態(tài)為γ-Fe(N)、γ’-Fe4N、ε-Fe3N中的一種或多種。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于:
(1)本發(fā)明提出的方法,利用二茂鐵粉末作為鐵源及碳源,以等離子作為合成環(huán)境,減少反應(yīng)物帶來的毒性及環(huán)境污染,利于大量生產(chǎn)。
(2)通過調(diào)控制備過程中等離子體的含氮比可以控制所獲得的磁性納米顆粒的物相。
(3)通過該途徑所制備的碳包覆的納米磁性粉末粒徑細(xì)小、分布均勻、球形度好,且制備流程簡(jiǎn)短。
本發(fā)明所制備的石墨烯包覆可相變態(tài)納米磁性復(fù)合材料同時(shí)具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性、磁性能及電性能,因此在靶向藥物、磁流體、吸波材料,鋰電池材料及催化劑等多個(gè)領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用潛力。
上述方法收集到的復(fù)合粉體除含有所需要的納米氮化鐵復(fù)合材料外,還含有一些未包覆的石墨烯粉末,且所生成的磁性顆粒(因本發(fā)明所選用石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料主要成分為氮化鐵,故在下文中也稱石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料為納米氮化鐵復(fù)合材料)的粒徑大小不一,可進(jìn)一步對(duì)其進(jìn)行篩選,以去除不具磁性的石墨烯粉末雜質(zhì),并將不同粒徑的磁性顆粒分開。
由于剛制得的上述這種石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料,其生物相容性,分散性都還具有一定缺陷,并不能直接用于DNA的提取。還需要對(duì)其進(jìn)行表面改性制備復(fù)合納米磁性微球,并對(duì)制得的微球進(jìn)行篩選便于標(biāo)準(zhǔn)化,這樣才能方便用于DNA的提取。為了將納米氮化鐵復(fù)合材料用于DNA的提取,本發(fā)明還建立了一個(gè)對(duì)上述納米氮化鐵復(fù)合材料進(jìn)行表面修飾,并將修飾后的微球用于DNA的提取的方法。
一種SiO2基復(fù)合磁性微球,其由SiO2對(duì)上述石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料進(jìn)行包覆而制得,即在上述石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料的表面包覆有SiO2層。
優(yōu)選地,所述SiO2基復(fù)合磁性微球中SiO2層的厚度約為180-200nm。
優(yōu)選地,所述SiO2基復(fù)合磁性微球的粒徑為200nm-300nm。
本發(fā)明還提供所述SiO2基復(fù)合磁性微球的制備方法,包括以下步驟:
1)稱取20mg上述石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料加入70ml含1%吐溫20的異丙醇中,超聲分散10min;
2)逐滴加入10ml含正硅酸乙酯的異丙醇;
3)加入一定比例的氨水和去離子水,調(diào)節(jié)pH至10,配成100ml懸濁液;
4)于45℃反應(yīng)1.5h-2h,離心,用無水乙醇洗沉淀;
5)將沉淀重懸浮于無水乙醇,用磁分離法去除未包覆到納米氮化鐵復(fù)合材料上的SiO2等雜質(zhì);
6)低速離心(轉(zhuǎn)速一般500-800rpm);將沉淀取出,干燥,即得。
正硅酸乙酯在堿性條件下水解產(chǎn)生SiO2,產(chǎn)生的SiO2團(tuán)聚在所述納米氮化鐵復(fù)合材料表面,形成SiO2的包覆層,當(dāng)包覆的微球達(dá)到某一大小(在本閥門所述的環(huán)境下約為200-300nm)時(shí),達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài),大小不再增長(zhǎng)。當(dāng)然,也有部分SiO2自身之間發(fā)生團(tuán)聚,形成SiO2微球,這些微球會(huì)在步驟5中被篩出。
進(jìn)一步地,還包括對(duì)所制得的SiO2基復(fù)合磁性微球進(jìn)行篩選的步驟,使所得的微球更好地用于DNA的提取。
具體地,所述篩選的方法包括:
1)將修飾好的SiO2基復(fù)合磁性微球重懸浮于無水乙醇,超聲分散(至少10min);
2)靜置沉淀(至少30min),分別收集沉淀和上清;
3)將步驟2)中的上清繼續(xù)靜置沉淀(至少30min);
4)重復(fù)上述步驟2)和3),直至上清靜置1h未形成沉淀為止。
經(jīng)上述方法篩選出的磁珠粒徑不等,粒徑主要分布在200nm-300nm之間。
本發(fā)明還包括上述石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料或SiO2基復(fù)合磁性微球在DNA提取上的應(yīng)用。
本發(fā)明還提供一種利用上述石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料或SiO2基復(fù)合磁性微球進(jìn)行提取DNA的方法,包括以下步驟:
1)使用合適的方法裂解樣品組織或者細(xì)胞,獲得裂解液;
2)去除裂解液中可能會(huì)吸附到所述納米氮化鐵復(fù)合材料或SiO2基復(fù)合磁性微球上的其它物質(zhì)(比如RNA和某些蛋白質(zhì));
3)向裂解液中加入所述石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料或SiO2基復(fù)合磁性微球和偶聯(lián)劑,使所述納米氮化鐵復(fù)合材料或SiO2基復(fù)合磁性微球與DNA結(jié)合;
4)磁分離,將吸附上DNA的所述石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料或SiO2基復(fù)合磁性微球與裂解液中的其它材料分離;
5)將DNA從所述石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料或SiO2基復(fù)合磁性微球上洗脫,獲得DNA。
優(yōu)選地,所述偶聯(lián)劑為鹽和聚乙二醇混合溶液;所述鹽可選用常用的可溶性中性鹽。
本發(fā)明方法即可用于質(zhì)粒DNA也可用于基因組DNA的提??;且能夠完成各種常規(guī)DNA的提取。
本發(fā)明新型納米氮化鐵復(fù)合材料是一種由石墨烯包覆的復(fù)合材料,具有核殼結(jié)構(gòu),外殼為石墨烯,磁性核為鐵的氮化物。與傳統(tǒng)氧化鐵磁性材料相比,這種材料有更好的磁性,在應(yīng)用方面更具優(yōu)勢(shì)。一方面,磁性強(qiáng)的材料,達(dá)到同樣的磁性要求它所用的量要更小。在外面包覆的介質(zhì)厚度相同的條件下,以氮化鐵為核心的復(fù)合微球可以做的更小。更小的體積帶來的是更大的相對(duì)表面積,有利于其表面各種反應(yīng)的發(fā)生,便于其和DNA的結(jié)合。另一方面,由于氮化鐵的磁性較強(qiáng),同種大小的顆粒,氮化鐵的磁性要強(qiáng)于氧化鐵,反應(yīng)在DNA的提取的過程中就是分離時(shí)氮化鐵的顆粒更加靈敏。選用納米氮化鐵復(fù)合材料的優(yōu)勢(shì)是它的磁響應(yīng)性好,分離靈敏、速度快等優(yōu)勢(shì),而且分離同樣的DNA,磁珠的用量會(huì)更少,更利于相關(guān)自動(dòng)化、高通量?jī)x器的研發(fā)。
附圖說明
圖1為實(shí)施例1、實(shí)施例2和實(shí)施例3制備得到的石墨烯包覆可相變態(tài)納米磁性復(fù)合材料的XRD圖譜。
圖2為實(shí)施例1制備的石墨烯包覆可變相態(tài)納米顆粒復(fù)合材料的粒徑分布及TEM圖
圖3和圖5為實(shí)施例2制備的石墨烯包覆可變相態(tài)納米顆粒復(fù)合材料的TEM圖。
圖4為實(shí)施例3制備的石墨烯包覆可變相態(tài)納米顆粒復(fù)合材料的TEM圖。
圖6為實(shí)施例5中篩選出的磁珠分散在溶液中的實(shí)物照片及其在外磁場(chǎng)下聚集的照片。
圖7為實(shí)施例6中提取的質(zhì)粒的DNA濃度鑒定結(jié)果,以及電泳照片。
圖8為實(shí)施例7中提取的人體組織DNA濃度結(jié)果,以及對(duì)其進(jìn)行β-globin基因片段擴(kuò)增鑒定的電泳照片。
圖9為實(shí)驗(yàn)例1中所用材料的振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)檢測(cè)圖。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例用于說明本發(fā)明,但不用來限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體技術(shù)或條件者,按照本領(lǐng)域內(nèi)的文獻(xiàn)所描述的技術(shù)或條件,或者按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者,均為可通過正規(guī)渠道商購買得到的常規(guī)產(chǎn)品。
本發(fā)明提出的墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性復(fù)合材料的制備方法,包括以下步驟:
(1)連續(xù)并多次對(duì)等離子體產(chǎn)生裝置的反應(yīng)腔體進(jìn)行惰性氣體清洗后,以惰性氣體充滿整個(gè)反應(yīng)腔體,隔絕空氣;
(2)通過等離子體電源激發(fā)得到穩(wěn)定的惰性氣體等離子體流后,通過輸入反應(yīng)氣源形成混合等離子體流,再將二茂鐵粉末熱蒸發(fā),以載流氣形式將二茂鐵蒸氣送入等離子體中心區(qū)域;
(3)利用等離子體高焓值及化學(xué)活化效果,將二茂鐵迅速熱解并發(fā)生化學(xué)反應(yīng)后,在等離子體焰流尾部通過形核長(zhǎng)大得到納米磁性顆粒并且在顆粒表面包覆石墨烯;
(4)在惰性氣體保護(hù)條件下將反應(yīng)腔降到室溫,收集得到的復(fù)合粉體,即為石墨烯包覆納米磁性顆粒復(fù)合材料。
采用的設(shè)備可以為已有的等離子體發(fā)生設(shè)備,實(shí)施例中,具體采用專利CN104851548A所公開的設(shè)備。
如無特別說明,實(shí)施例中采用的手段均為本領(lǐng)域常規(guī)的技術(shù)手段。
實(shí)施例中石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性復(fù)合材料的制備的具體工藝如下:
實(shí)施例1:
以市售二茂鐵粉為原料,多次用氬氣清洗反應(yīng)腔體后,以氬氣為等離子形成氣建立穩(wěn)定運(yùn)行的氬等離子體,其中氬氣流量為5slpm,邊保護(hù)氣氬氣流量為5slpm。恒溫流床溫度設(shè)置為120℃,通過流量為3slpm的氬氣將二茂鐵蒸氣送入等離子體焰流中,經(jīng)過等離子體高溫分解和活化反應(yīng)得到石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性顆粒,產(chǎn)物的XRD圖如圖1所示,TEM圖及粒徑分布如圖2所示。
由圖1可知,實(shí)施例1的物相組成為α-Fe、γ-Fe和C。由圖2可知,得到的石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性復(fù)合材料粒徑分布在10~90nm之間,平均粒徑在26.3nm。顆?;境是蛐位驒E球型且被殼層包覆,測(cè)得核芯直徑和殼層厚度約分別為20nm和5nm。經(jīng)過對(duì)核殼的晶層間距進(jìn)行測(cè)量發(fā)現(xiàn),殼層的晶面間距約為0.35nm,與石墨烯的(002)面的晶面間距接近,這說明殼層由多層石墨烯片共同組成;核的晶面間距為0.203nm,與α-Fe的(110)晶面間距和/或γ-Fe的(111)晶面間距接近,這與XRD數(shù)據(jù)相符合。復(fù)合材料粒度分布均勻、球形度好。
實(shí)施例2:
以市售二茂鐵粉為原料,多次用氬氣清洗反應(yīng)腔體后,以氬氣和氮?dú)鉃榈入x子形成氣共同建立穩(wěn)定運(yùn)行的氬氮等離子體,其中氬氣流量為5slpm,氮?dú)饬髁繛?slpm,邊保護(hù)氣氬氣流量為10slpm。恒溫流床設(shè)置為160℃,載氣流量為1slpm的氬氣,其他操作同實(shí)施例1。得到石墨烯包覆氮化鐵納米磁性顆粒的XRD圖如圖1所示,TEM圖如圖3所示。
由圖1可知,實(shí)施例2制備的產(chǎn)物的物相組成為γ-Fe(N)、γ’-Fe4N、ε-Fe3N。由圖3和圖5可見,得到的石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性復(fù)合材料粒徑分布在10~90nm之間,具有明顯的核殼結(jié)構(gòu),核芯外包覆多層的石墨烯片層。復(fù)合材料的分布均勻、球形度好。
實(shí)施例3:
以市售二茂鐵粉為原料,多次用氬氣清洗反應(yīng)腔體后,以氬氣和氮?dú)鉃榈入x子形成氣共同建立穩(wěn)定運(yùn)行的氬氮射頻等離子體,其中氬氣流量為5slpm,氮?dú)饬髁繛?slpm,邊保護(hù)氣氬氣流量為10slpm。恒溫流床設(shè)置為180℃,其他操作同實(shí)施例2。得到石墨烯包覆氮化鐵納米磁性顆粒的XRD圖如圖1所示,TEM圖如圖4所示。
由圖1所示,實(shí)施例3的物相組成為γ-Fe(N)、ε-Fe3N。由圖4可見,得到的石墨烯包覆可變相態(tài)納米磁性復(fù)合材料粒徑分布在10~110nm之間,具有明顯的核殼結(jié)構(gòu),核芯外包覆多層的石墨烯片層。復(fù)合材料的分布均勻、球形度好。
以上方法收集到的粉體除我們需要的磁性材料粉體外,還存在一些未包覆的石墨烯粉末,并且生成的磁性顆粒的粒徑大小不一,需對(duì)其進(jìn)行篩選,去除不具磁性的石墨烯粉末雜質(zhì),并將不同粒徑的磁性顆粒分開。
實(shí)施例4:SiO2基復(fù)合磁性微球及其制備(納米氮化鐵的表面修飾)
使用生物相容性更好,且易進(jìn)行表面修飾的SiO2對(duì)所實(shí)施例2制得的納米氮化鐵復(fù)合材料進(jìn)行包覆,使其易于與DNA結(jié)合。
使用水解法用SiO2包覆納米氮化鐵復(fù)合材料,包括以下步驟:
①稱取20mg實(shí)施例1制得的納米氮化鐵復(fù)合材料加入70ml含1%吐溫20的異丙醇中,超聲分散10min;
②逐滴加入10ml含正硅酸乙酯的異丙醇;
③加入一定比例的氨水和去離子水,調(diào)節(jié)PH至10,配成100ml懸濁液;
④45℃反應(yīng)1.5h-2h,離心,用無水乙醇洗沉淀;
⑤將沉淀重懸浮于無水乙醇,用磁分離法去除未包覆到納米氮化鐵復(fù)合材料上的SiO2等雜質(zhì);
⑥低速離心(轉(zhuǎn)速500-800rpm);
⑦將沉淀取出,干燥。
實(shí)施例5:篩選出適合于DNA提取的磁珠
①將實(shí)施例4修飾好的SiO2基復(fù)合磁性微球(磁珠)重懸浮于無水乙醇,超聲分散10min;
②靜置沉淀30min,分別收集沉淀和上清;
③將步驟②中的“上清”繼續(xù)靜置沉淀30min;
④重復(fù)上述步驟②、③,直至上清靜置1h未形成沉淀為止。
經(jīng)測(cè)試,靜置1h未形成沉淀的磁珠均可用于DNA的提取。以上述方法篩選出的磁珠粒徑不等,粒徑主要分布在200nm-300nm之間。
圖6為本實(shí)施例所篩選出的磁珠分散在溶液中的實(shí)物照片及其在外磁場(chǎng)下聚集的照片。
實(shí)施例6:SiO2基復(fù)合磁性微球用于質(zhì)粒DNA提取的方法
將實(shí)施例5制得的包覆好的磁珠,以一定濃度的鹽和聚乙二醇溶液作為偶聯(lián)劑,使其與DNA以氫鍵結(jié)合;提取、分離后用Tris緩沖溶液或者蒸餾水將DNA從復(fù)合微球上洗脫。
所用的大腸桿菌類型為XL1-Blue/pQE30,所用菌液由該種菌于37℃培養(yǎng)12h獲得。
細(xì)菌裂解方法:
①取5ml大腸桿菌液于離心管中10000x離心1min;
②棄上清,加入150ul溶液I(50mM葡萄糖,25mM Tris-HCl(pH 8.0),10mM EDTA(pH 8.0));
③加入150ul溶液II(用0.4N的NaOH和2%的SDS等體積混合)反復(fù)翻轉(zhuǎn)數(shù)次,室溫靜置5min;
④加入150ul溶液III(醋酸鉀(KAc)緩沖液,pH 4.8),混合翻轉(zhuǎn)數(shù)次,至白色絮狀沉淀生成,14000x,4℃離心10min;
⑤取出上清,即得裂解液。
磁珠用于質(zhì)粒DNA提取方法:
①向裂解液中加入450ul聚乙二醇和NaCl混合溶液,加入實(shí)微量施例3制備的SiO2基復(fù)合磁性微球,反復(fù)顛倒混勻數(shù)次,靜置5min;
②將離心管置于磁力架上,磁分離,去上清;
③用無水乙醇清洗沉淀,將離心管置于磁力架上,再次進(jìn)行磁分離,去上清;
④待無水乙醇揮發(fā),加入去離子水或者TE溶液溶解DNA;
⑤將離心管置于磁力架上,分離磁珠,吸出上清,所得溶液即為所提DNA。
圖7為本實(shí)施例所提取的質(zhì)粒的DNA濃度鑒定結(jié)果,以及電泳照片。
實(shí)施例7:磁性微球用于基因組DNA提取的方法
①將所需提取的組織、細(xì)胞樣本進(jìn)行預(yù)處理(絞碎、沉淀等);
②加1ml 10%SDS裂解液,混勻;
③加50ul(1mg)蛋白酶K,37℃恒溫反應(yīng)數(shù)小時(shí),直到組織完全解體;
④鹽析,加入5mol/L氯化鈉溶液,混勻數(shù)次,5000r離心1min,取上清;
⑤加入450ul聚乙二醇和NaCl混合溶液,加入微量實(shí)施例5制備的SiO2基復(fù)合磁性微球,反復(fù)顛倒混勻數(shù)次,靜置5min;
⑥將離心管置于磁力架上,磁分離,去上清;
⑦用無水乙醇清洗沉淀,將離心管置于磁力架上,再次進(jìn)行磁分離,去上清;
⑧待無水乙醇揮發(fā),加入去離子水或者TE溶液溶解DNA;
⑨將離心管置于磁力架上,分離磁珠,吸出上清,所得溶液即為所提DNA。
圖8為本實(shí)施例所提取的DNA(人體組織)濃度結(jié)果,以及對(duì)其進(jìn)行β-globin基因片段擴(kuò)增鑒定的電泳照片。
實(shí)驗(yàn)例1
圖9為實(shí)施例1所選用的石墨烯包覆納米氮化鐵復(fù)合材料的主要成分的振動(dòng)樣品磁強(qiáng)計(jì)(VSM)檢測(cè)圖,其飽和磁性強(qiáng)度為184.41emu/g。
已知室溫下Fe3O4飽和磁化強(qiáng)度92emu/g,F(xiàn)e4N的飽和磁化強(qiáng)度為193emu/g??梢?,本發(fā)明所用材料的磁性要好于傳統(tǒng)的Fe3O4相關(guān)材料。
雖然,上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實(shí)施方案對(duì)本發(fā)明作了詳盡的描述,但在本發(fā)明基礎(chǔ)上,可以對(duì)之作一些修改或改進(jìn),這對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此,在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進(jìn),均屬于本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。