一種電噴霧離子化裝置及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基于細胞的藥物分析領(lǐng)域，尤其涉及一種電噴霧離子化裝置及其在基 于細胞的藥物分析中的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 基于細胞的藥物分析一直在生物醫(yī)藥和藥學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。傳統(tǒng) 的基于細胞的藥物分析方法需要培養(yǎng)大量細胞，并且經(jīng)過復(fù)雜的操作程序才能獲得充分的 數(shù)據(jù)。這些傳統(tǒng)的分析方法往往存在試劑消耗量大、耗時和低通量的缺點。
[0003]質(zhì)譜則是一種較為快速的分析方法，該方法可以提供高靈敏度、高通量和分子級 別的化學(xué)信息。作為一種多功能的分析技術(shù)，質(zhì)譜可與電泳、色譜等聯(lián)用以分離和提取相關(guān) 的藥物成分，從而提高藥物分析的靈敏度、精確度和針對性。文獻1將電噴霧質(zhì)譜與毛細管 電泳聯(lián)用，可自動分析單個紅細胞中的血紅素和血紅蛋白中的a和0取代基。然而，用于質(zhì)譜 分析的樣品往往需要先進行復(fù)雜的離線預(yù)處理，因此，只能進行脫離細胞微環(huán)境的離線藥 物分析，而有效的藥物分析要求分析條件應(yīng)盡可能接近于體內(nèi)微環(huán)境，這導(dǎo)致樣品前處理 成為質(zhì)譜用于藥物分析的一大障礙。
[0004] 為了克服上述困難，人們開始發(fā)展常態(tài)離子化質(zhì)譜，以省略樣品前處理步驟，實現(xiàn) 在自然狀態(tài)下分析和鑒定樣品。文獻2利用一根短的、錐形的毛細管作為納升級的取樣和噴 霧工具，在質(zhì)譜檢測器前產(chǎn)生氣態(tài)離子，可用于檢測一系列復(fù)雜基質(zhì)中的分子而無需樣品 前處理。文獻3則利用穿刺針直接進行組織中的樣品噴霧，可得到精確的分子信息。文獻4和 文獻5則分別用醫(yī)用棉簽和牙簽進行電噴霧，用于藥物分析。在這其中，紙基電噴霧逐漸發(fā) 展成為一種成熟的常態(tài)離子化方法，用于復(fù)雜樣品的分析。電解質(zhì)通過毛細作用運輸?shù)郊?基的尖端，施加高電場后形成離子噴霧。紙噴霧質(zhì)譜由于其簡單的操作和易得的設(shè)備，常用 于細胞培養(yǎng)基中的生物分子檢測、生物流體分析和食品安全的監(jiān)測。纖維素色譜紙和硝酸 纖維素膜是常用的紙基。然而，這些紙基因其較差的生物相容性令細胞難以在其上附著，因 其不透明性又無法實現(xiàn)對細胞的光學(xué)手段實時監(jiān)測，從而限制了其在基于細胞的研究中的 應(yīng)用。因此，能夠用于基于細胞的藥物分析的常態(tài)離子化的裝置和方法亟待發(fā)展。
[0005] 相關(guān)技術(shù)文獻
[0006] 文南犬 1: Integrated Microfluidic Device for Automated Single Cell Analysis Using Electrophoretic Separation and Electrospray Ionization Mass Spectrometry(Mellors J.S.；Jorabchi K.；Smith L.M.；Ramsey J.M.Anal.Chem.,2010, 82,967-973)。
[0007] 文南犬2:Capillary Action-Supported Contactless Atmospheric Pressure Ionization for the Combined Sampling and Mass Spectrometric Analysis of Biomolecules(Hsieh C.；Chang C.；Urban P.L.；Chen Y.Anal.Chem.,2011,83,2866-2869)〇
[0008] 文獻3:Biological tissue diagnostics using needle biopsy and spray ionization mass spectrometry(Liu J.；Cooks R.G.；0uyang Z.Anal.Chem.,2011,83, 9221-9225)〇
[0009] 文南犬4:Direct drug analysis from oral fluid using medical swab touch spray mass spectrometry(Pirro V.；Jarmusch A?K?;Vincenti M.；Cooks R.G.Anal.Chim.Acta,2015,861,47-54)〇
[0010] 文南犬5: Internal standard mass spectrum fingerprint:A novel strategy for rapid assessing the quality of Shuang-Huang-Lian oral liquid using wooden-tip electrospray ionization mass spectrometry(Yang Y.；Deng J.Anal.Chim.Acta,2014,837,83-92)〇

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 鑒于上述技術(shù)問題，本發(fā)明的目的在于提供一種用于基于細胞的藥物分析的常態(tài) 離子化質(zhì)譜檢測的電噴霧離子化裝置，通過玻璃基底提供較高的生物相容性，可用于細胞 中藥物的定性和定量分析，還可用于藥物作用后的細胞的生物分析。
[0012] 本發(fā)明的一個實施方式在于提供一種電噴霧離子化裝置，包括：
[0013] 具有至少一個尖端的玻璃基底，其上設(shè)置有多個微通道；
[0014] 用于施加高電壓并夾住所述玻璃基底的導(dǎo)電夾；以及 [0015]用于放置所述玻璃基底的腔室。
[0016] 本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，通過基于玻璃基底的電噴霧離子化裝置能夠提供較 高的生物相容性，從而易于實現(xiàn)細胞在其上的貼壁和生長，同時由于玻璃基底的透明性，也 易于實現(xiàn)對細胞的實時監(jiān)測。另一方面，通過在所述玻璃基底上設(shè)置多個微通道，由于微通 道的表面張力作用，細胞之間不會相互混合，可實現(xiàn)多種細胞的共培養(yǎng)，從而有利于對細胞 在共培養(yǎng)條件下的藥物作用進行定性或定量檢測。
[0017] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，所述多個微通道通過光刻掩膜法設(shè)置在所述 玻璃基底上。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明，通過在所述玻璃基底上旋涂負光膠、烘烤后，將畫有微通道圖案的掩 膜(微通道部分為透光膜，其余部分不透光)覆蓋在涂有負光膠的玻璃基底上，在光刻機上 進行紫外曝光3次，每次30s，以使被透光掩膜覆蓋的負光膠固化;然后揭掉掩膜并用顯影液 進行顯影，以去除未被固化的負光膠;再用氮氣吹干，玻璃基底上因固化而未被去除的負光 膠將玻璃基底分隔成多個微通道，即得到設(shè)置有微通道的玻璃基底。
[0019] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述多個微通道的寬度為l-3mm，深度為 10-50M1，個數(shù)為2-5個。
[0020] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述玻璃基底為被切割成銳角三角形，優(yōu) 選為等腰銳角三角形的蓋玻片，邊長均小于lcm，厚度為5-20M1。
[0021]在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述電噴霧離子化裝置包括片狀高聚物材 料，所述腔室形成在所述片狀高聚物材料上，并且所述腔室的形狀與所述玻璃基底的形狀 相適應(yīng)。
[0022]根據(jù)本發(fā)明，所述腔室的形狀與所述玻璃基底的形狀相適應(yīng)，表示所述腔室與所 述玻璃基底的形狀相同或相似，所述腔室的面積略大于所述玻璃基底。
[0023] 在本發(fā)明的一個具體的實施方式中，所述腔室通過如下步驟形成:準備兩片同樣 大小和形狀的片狀高聚物材料，在其中一片上挖出一個與所述玻璃基底的形狀相適應(yīng)的空 洞，層疊在另一片狀高聚物材料上，從而構(gòu)成腔室。
[0024] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式中，所述片狀高聚物材料為有機硅聚合物，優(yōu) 選為聚二甲基硅氧烷(PDMS)。
[0025] 本發(fā)明的另一個實施方式在于提供一種利用上述電噴霧離子化裝置進行細胞內(nèi) 藥物吸收的質(zhì)譜檢測的方法，包括：
[0026] 向玻璃基底的多個微通道內(nèi)分別注入細胞懸液，并培養(yǎng)過夜；
[0027] 采用藥物作用于培養(yǎng)過夜的待測細胞；
[0028] 對于經(jīng)藥物作用的待測細胞吸收的藥物通過質(zhì)譜儀進行檢測。
[0029] 在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方式中，采用藥物作用于培養(yǎng)過夜的待測細胞的時間 為 24h。
[0030] 在本發(fā)明的另一個優(yōu)選的實施方式中，通過質(zhì)譜儀進行檢測包括：用導(dǎo)電夾夾住 玻璃基底放置于質(zhì)譜儀前，將玻璃基底的一個尖端正對質(zhì)譜儀的進樣口，通過導(dǎo)電夾施加 高壓電，對待測細胞所在的微通道內(nèi)滴加有機溶劑，產(chǎn)生電噴霧后進行檢測。
[0031] 本發(fā)明的再一個實施方式在于提供一種利用上述電噴霧離子化裝置進行細胞凋 亡率檢測的方法，包括：
[0032] 向玻璃基底的多個微通道內(nèi)分別注入細胞懸液，并培養(yǎng)過夜；
[0033] 采用藥物作用于培養(yǎng)過夜的待測細胞；
[0034] 用熒光探針對經(jīng)藥物作用的待測細胞進行染色，并分析細胞凋亡情況。
[0035] 本發(fā)明的又一個實施方式在于提供上述電噴霧離子化裝置在基于細胞的藥物分 析中的應(yīng)用。
[0036] 根據(jù)本發(fā)明所提供的電噴霧離子化裝置，通過玻璃基底提供較高的生物相容性， 通過微通道實現(xiàn)多種細胞的共培養(yǎng)，能夠廣泛用于藥物作用后的細胞中的藥物分析和生物 分析，尤其是在對細胞在共培養(yǎng)狀態(tài)下的藥物分析和生物分析中具有明顯的優(yōu)勢。根據(jù)本 發(fā)明所提供的質(zhì)譜檢測的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)基于細胞的藥物分析的常態(tài)離子化，有利于提高 藥物分析的精確度和可重復(fù)性。
【附圖說明】
[0037] 圖1顯示的是根據(jù)本發(fā)明的玻璃基電噴霧離子化裝置與質(zhì)譜聯(lián)用的結(jié)構(gòu)示意圖， 在圖1中，1-導(dǎo)電夾;2-玻璃基底;3-片狀高聚物材料;4-腔室;5-有機溶劑;6-電噴霧;7-質(zhì) 譜儀進樣口。
[0038]圖2顯示的根據(jù)本發(fā)明的實施例2進行HepG2、Cac〇-2和MCF-7三種細胞共培養(yǎng)的示 意圖。
[0039]圖3顯示的是根據(jù)本發(fā)明的實施例2進行HepG2、Caco-2和MCF-7三種細胞共培養(yǎng)的 激光共聚焦顯微照片。
[0040] 圖4顯示的是根據(jù)本發(fā)明的實施例2進行HepG2、Cac〇-2和MCF-7三種細胞共培養(yǎng)1-3天的細胞存活率分析圖，圖中顯示的是三組平行實驗的結(jié)果。
[0041] 圖5顯示的是根據(jù)本發(fā)明的實施例3對共培養(yǎng)的MCF-7細胞內(nèi)吸收的CPA的定性質(zhì) 譜檢測圖，右上角的插圖為CPA的分子式和分子量。
[0042]圖6顯示的是根據(jù)本發(fā)明的實施例3對單培養(yǎng)的MCF-7細胞內(nèi)吸收的CPA的定性質(zhì) 譜檢測圖。
[0043]圖7顯示的是根據(jù)本發(fā)明的實施例4以同位素CPA-d4為內(nèi)標所做的質(zhì)譜定量檢測 標準曲線。
[0044] 圖8顯示的是根據(jù)本發(fā)明的實施例4定量檢測MCF-7細胞內(nèi)CPA吸收量的結(jié)果，圖中 顯示的是三組平行實驗的結(jié)果，圖中*表示有顯著差別。
[0045] 圖9顯示的是根據(jù)本發(fā)明的實施例5對共培養(yǎng)和單培養(yǎng)的MCF-7細胞進行CPA藥物 作用后的細胞凋亡分析圖，圖中顯示的是三組平行實驗的結(jié)果，圖中*表示有顯著差別。
[0046] 圖10顯示的是根據(jù)本發(fā)明的實施例5對共培養(yǎng)和單培養(yǎng)的MCF-7細胞進行Dox藥物 作用后的細胞凋亡分析圖，圖中顯示的是三組平行實驗的結(jié)果，圖中*表示有顯著差別。
【具體實施方式】
[0047]以下通過實施例對本發(fā)明進行詳細說明，但本發(fā)明的保護范圍并不限于下述說 明。若無特殊說明，所用實驗方法為常規(guī)實驗方法;所使用的試劑和材料等均可通過商業(yè)途 徑獲得。
[0048]實施例1電噴霧離子化裝